دوره 34، شماره 9 - ( 9-1402 )
جلد 34 شماره 9 صفحات 534-518 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Shahbazi Azar S, Hasani Kumle S H, Yamchi A, Shahbazi M. OPTIMIZATION OF PRODUCTION OF RECOMBINANT ROMIPLOSTIM PEPTIBODY IN ESCHERICHIA COLI. Studies in Medical Sciences 2023; 34 (9) :518-534
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-6084-fa.html
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-6084-fa.html
شهبازی آذر صالح، حسنی کومله سید حسن، یامچی احد، شهبازی مجید. بهینه سازی تولید پپتیبادی رومیپلاستیم نوترکیب در اشرشیا کلی. مجله مطالعات علوم پزشکی. 1402; 34 (9) :518-534
دانشیار بیوشیمی و بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران (نویسنده مسئول) ، S_shahabzi58@yahoo.com
متن کامل [PDF 655 kb]
(844 دریافت)
| چکیده (HTML) (1632 مشاهده)
جدول (1): طراحی آزمایش مرحله اول با RSM
استخراج پروتئین با استفاده از سانتریفیوژ، امواج اولتراسوند و بافر شستشو، SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis) و وسترن بلاتینگ با استفاده از مقاله ابراهیمی‌فرد و همکاران و طبق روش آن‌ها صورت گرفت (24). در انتها خالص‌سازی پروتئین نوترکیب انجام شد، رسوب حاصل از فرمنتیشن (اینکلوژن بادی) را در محلول حاوی گوانیدین 6 مولار، تریس 50 میلی مولار، DTT (Dithiothreitol) 8 میلی مولار با pH=8.7 به مدت یک ساعت حل گردید. سپس آن را در اوره 2 مولار، تریس 50 میلی مولار، آرژنین 160 میلی مولار، سیستئین 3 میلی مولار با pH=8.5، 20 برابر رقیق نموده و به مدت یک شب بر روی استیرر و در جای سرد قرار داده شد. حال محلول را در تریس 10 میلی مولار و اوره 5/1 مولار با pH=9 حل کرده و سپس آن را سانتریفیوژ و سوپرناتانت آن به ستون sp-سفارز لود شد و همراه آن از نمک 100 میلی مولار با pH=5 به‌صورت گرادیانت تا 500 میلی مولار استفاده گردید. (25).
یافته‌ها
توالی ژن و بهینه‌سازی کدونی:
توالی آمینواسیدی پیتیبادی رومیپلاستیم و توالی نوکلئوتیدی آن از پایگاه داده Drug bank (www.drugbank.ca) برداشته شد. برای اطمینان از بیان مطلوب ژن خارجی در باکتری، توالی ژنی بر اساس ترجیح کدونی بهینه‌سازی گردید. بهینه‌سازی بر اساس ترجیح کدونی، کدون دوتایی و ساختار دوم توالی mRNA (Messenger RNA) با استفاده از سایت Genescript انجام گرفت (http://www.genescript.com).
.png)
.png)
انتخاب بهترین محیط کشت:
فاکتورهای زیادی بر شرایط تخمیر مؤثر می‌باشند که می‌توانند بر رشد باکتری‌ها اثر بگذارند، یکی از آن‌ها نوع محیط کشت مورد استفاده می‌باشد. که ما در این مرحله از محیط کشت های LB, TB (Terrific Broth), M9 (Minimal Salts) که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان رومیپلاستیم استفاده نمودیم و با توجه به شکل 5 می‌توان بیان کرد که تغییرات محیط کشت به‌طور معنی‌داری بر میزان بیان رومیپلاستیم تأثیر داشته است (P<0.05). با توجه به شکل 5 همان گونه که مشخص است، میزان بیان رومیپلاستیم هم راستا با تغییر محیط کشت روند افزایشی داشته و نمونه‌های حاوی محیط کشت LB سبب بیشترین میزان بیان رومیپلاستیم شده همچنین کمترین میزان بیان رومیپلاستیم در محیط کشت M9 بوده است.
جدول (2): بررسی اثر مستقل و متقابل متغیرها بر روی هر پاسخ
جدول (3): ANOVA عدم برازش برای سطح پاسخ مدل
جدول (4): بهینه‌سازی تیمارها و پیشنهاد بهترین تیمار
ارزیابی بیان رومیپلاستیم با استفاده از الکتروفورز:
باکتری ترانسفورم شده در حضور القا کننده بیان، کشت داده شد. قبل از افزودن IPTG یک نمونه به‌عنوان کنترل برداشته شد. پس از اتمام نمونه‌گیری استخراج پروتئین کل انجام گردید. 20 میکرولیتر از پروتئین استخراج شده پس از جوشاندن بر روی ژل SDS-PAGE الکتروفورز گردید که نتیجه آن در شکل 6 نشان داده شده است. وزن مولکولی رومیپلاستیم قبل از خالص‌سازی 30 کیلو دالتون می‌باشد. همچنین برای تأیید پروتئین موردنظر از تست وسترن بلاتینگ نیز استفاده گردید (شکل 7).
.png)
متن کامل: (635 مشاهده)
مقدمه
رومیپلاستیم یک پروتئین پیوندی و آنالوگ ترومبوپویتین است. ترومبوپویتین هورمونی است که تولید پلاکت را کنترل می‌کند. این دارو در درمان پورپورای ناشناس کاهش پلاکت توسط سازمان غذا و دارو آمریکا به‌منظور استفاده در مواردی از این بیماری که پاسخی به درمان‌های رایج همچون ایمونوگلوبولین وریدی، کورتون‌ها، تزریق روگام و جراحی طحال‌برداری نداده‌اند، تأیید شده است. رومیپلاستیم با استفاده از فن‌آوری DNA نوترکیب در E.coli تولید می‌شود و وزن مولکولی تقریبی آن نیز برابر 60 کیلو دالتون است (4-1). پیشرفت در مهندسی ژنتیک و پروتئین‌های نوترکیب مانند هر رشته علمی دیگر به در دسترس بودن تکنیک‌ها و روش‌هایی که دامنه و دقت آزمایش‌ها را گسترش می‌دهند، وابسته است (6,5). رومیپلاتسیم یک پپتیبادی است که شامل چهار اتصال TPO-R (Targeting Thrombopoietin receptor) است، دمین‌ها (شناسایی‌شده به‌وسیله غربالگری کتابخانه‌های جهش‌زایی پپتیدی) میل ترکیبی بالایی برای TPO-R (MPL (Myeloproliferative Protein Leukemia) و یک دمین حامل Fc (fragment crystallizable) دارند و با توالی با TPO درون‌زا همسانی ندارد، رومیپلاستیم به TPO-R روی پیش‌سازهای مگاکاریوسیت در مغز استخوان متصل می‌شود و آن را فعال می‌کند. به همان روش TPO درون‌زا متصل می‌شود و می‌تواند TPO را از گیرنده آن جابجا کند، رومیپلاستیم بسیاری از مسیرهای مشابه TPO را فعال می‌کند، که منجر به بهبود مستمر تعداد پلاکت‌ها با ادامه درمان در بیماران مبتلابه ITP (Immune Thrombocytopenic Purpura) می‌شود (7). تعامل با گیرنده‌های Fcγ ممکن است به رومیپلاتسیم اجازه دهد تا حفظ تحمل هومورال، بلوغ سلولی، ارائه آنتی‌ژن و گسترش سلول‌های T تنظیم‌کننده را اصلاح کند. درنهایت، رومیپلاتسیم ممکن است بتواند سلول‌های T تنظیم‌کننده را از طریق دو اپی توپ از ناحیه Fc به نام اپی‌توپ‌های تنظیمی T فعال کند. کاوش بیشتر در مورد این مکانیسم‌ها در عملکرد پپتی‌بادی‌ها ضروری است. اتصال رومیپلاستیم طیف وسیعی از مسیرهای سیگنالینگ را فعال می‌کند که زنده ماندن سلولی، رشد سلولی، اندومیتوز مگاکاریوسیتی، بلوغ مگاکاریوسیتی، و مهم‌تر از همه، تولید پلاکت را افزایش می‌دهد (7). رومیپلاستیم دامنه خارج سلولی TPO-R را فعال می‌کند، درحالی‌که الترومبوپاگ و اواترومبوپاگ (نوعی روش درمانی) بخش گذرنده TPO-R را فعال می‌کنند، که می‌تواند منجر به سطوح مختلف فعالیت TPO-R و درنتیجه پاسخ‌های متفاوت در بخش سلول‌های بنیادی و مگاکاریوسیت شود. داده‌های مختلف نشان می‌دهد که اتصال رومیپلاتسیم منجر به فسفوریلاسیون تیروزین و فعال شدن متعاقب آن مسیرهای سیگنالینگ پایین‌دستی Mp1، JAK2-STAT5، ERK1/2 و AKT می‌شود که منجر به رونویسی ژن و افزایش تکثیر مگاکاریوسیتی می‌گردد. مشابه با TPO درون‌زا، رومیپلاتسیم رشد سلول‌های تشکیل‌دهنده کلنی مگاکاریوسیت را تحریک می‌کند و تعداد مگاکاریوسیت‌ها، اندازه و پلوئیدی را افزایش می‌دهد. نقش کلات آهن داخل سلولی در اثر الترومبوپاگ منحصربه‌فرد است، اما تأثیر بالینی آن مشخص نیست. درمجموع، این ویژگی‌های رومیپلاتسیم دلایلی را روشن می‌کند که چرا یک گزینه درمانی خوب برای ITP (Immune thrombocytopenia) است و ممکن است در سایر شرایط هماتولوژیک که منجر به ترومبوسیتوپنی می‌شوند مفید باشد (9-7). رومیپلاستیم هم‌زمان با اریتروپویتین، فاکتور سلول‌های بنیادی IL-3 (Interleukin 3)، IL-6 (Interleukin 6) و GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) در تحریک رشد کلنی مگاکاریوسیت در شرایط آزمایشگاهی عمل می‌کند (10). فاکتورهای رشد خونی متعددی باعث تحریک تولید پلاکت‌ها ازجمله فاکتور محرک کلونی گرانولوسیت- ماکروفاژ (GM-CSF)، فاکتور سلول‌های بنیادی، اینترلوکین 1، اینترلوکین 3، اینترلوکین 6 و اینترلوکین 11 می‌شوند. برخی از این فاکتورهای رشد نشان می‌دهند که باعث افزایش تولید پلاکت در بیماران مبتلا به شیمی‌درمانی می‌شوند. اینترلوکین 11 در حال حاضر توسط غذا و داروی ایالات‌متحده برای درمان ترومبوسیتوپنی ناشی از شیمی‌درمانی تأیید شده است. نقش اصلی این عوامل تولید پلاکت نیست بلکه ترومبوپویتین فاکتور رشدی است که برای تولید پلاکت بسیار مهم است (13-11). با توجه به مزایای مولکول ترومبوپویتین نوترکیب انسانی، تلاش شد تا ترومبوپویتین جدیدی ایجاد شود که آنتی‌ژن نبوده و خواص دارویی را بهبود بخشد. در سال 1997، یک پپتید 14 آمینواسیدی شناسایی شد که هیچ‌گونه توالی مشترکی با ترومبوپویتین نداشت اما به گیرنده ترومبوپویتین متصل و آن را فعال می‌کرد. اتصال پیوند شیمیایی دو پپتید 14 اسید آمینه‌ایی در مقایسه با ترومبوپویتین نوترکیب باعث شد تا فعالیت آن ده هزار برابر افزایش پیدا کند (14). پپتید دایمر به علت دارا بودن دو سایت اتصال مختلف به رسپتور، می‌تواند مانند ترومبوپویتین درون‌زا به‌طور مؤثری به گیرنده ترومبوپوتین متصل و آن را فعال نماید. ترومبوپویتین پایدار و فعال با اتصال چهار پپتید حاوی 14 اسیدآمینه به پایانه کربوکسیل قطعه IgG1 Fc (Immunoglobulin G1) حاصل شد که درنهایت یک پلتفرم بیولوژیکی جدید به نام پپتیبادی ایجاد شد (16,15). فیاض و همکاران در مطالعه‌ای به بیان، خالص‌سازی و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پپتیبادی بیوسیملار رومیپلاستیم پرداختند. آن‌ها از یک سازه حاوی باکتری اشرشیاکلی ادغام‌شده با پپتیبادی استفاده نمودند (17).
با عنایت به اینکه تاکنون در خصوص بهینه‌سازی شرایط بیان ژن رومیپلاستیم مطالعه‌ای انجام نشده است، لذا مطالعه حاضر باهدف کلونینگ و بهینه‌سازی شرایط بیان ژن و خالص‌سازی پپتیبادی رومیپلاستیم نوترکیب در باکتری اشرشیا کلی انجام گردید.
مواد و روش کار
در این پژوهش کاربردی از باکتری (Escherichia coli) E.coli سویه BL21 برای بیان رومیپلاستیم استفاده شد. وکتور مورد استفاده در این مطالعه pET9a است. این وکتور دارای مارکر انتخابی کانامایسین و پروموتور T7 است. مراحل تهیه کشت بر اساس روش Zurawa-Janicka و همکاران (2017) انجام شد. به‌طور خلاصه، پس از تهیه LB broth، به آن سلول میزبان BL21 اضافه شد (18). برای استخراج پلاسمید از تک کلنی‌های کشت داده‌شده داخل پلیت با استفاده از لوپ برداشته شد و داخل محیط LB broth کشت داده و مقدار 5 میکرولیتر (mg/L 50) آنتی‌بیوتیک کانامایسین نیز اضافه گردید. سپس پلاسمید pET9a در مقیاس کوچک طبق دستورالعمل با کیت Thermo استخراج گردید. واکنش زنجیره پلی‌مراز (Polymerase Chain Reaction) در حجم 25 میکرولیتر شامل 75/12 میکرولیتر آب‌مقطر دو بار تقطیر، 5/2 میکرولیتر بافر واکنش x10، 5 /0 میکرولیتر مخلوط نوکلئوتیدی 10 میلی مولار، 5/0 میکرولیتر از هر دو پرایمر اختصاصی (10 پیکومول)، 5/0 میکرولیتر آنزیم تک پلی‌مراز (5 واحد/میکرولیتر) و 5 میکرولیتر DNA (50 نانوگرم) استفاده گردید. در این مطالعه از یک برنامه چرخه حرارتی به‌طور اختصاصی برای پرایمرها استفاده گردید. برای مرحله واسرشت اولیه دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه اعمال شد. تکثیر در 35 سیکل شامل 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 56 درجه به مدت 1 دقیقه و دمای گسترش 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 50 ثانیه صورت گرفت. یک سیکل نهایی شامل مرحله گسترش نهایی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه بود. محصول PCR در ژل اگارز 5/1 درصد TBE و با ولتاژ ثابت 80 ولت در 80 دقیقه الکتروفورز شد (19,20).
برای درج قطعه نوترکیب در پلاسمید، ابتدا لازم است که هم قطعه نوترکیب و هم پلاسمید به‌وسیله آنزیم‌های محدودگر یکسان، بریده شوند. برای انجام هضم آنزیمی در ابتدا و انتهای قطعه نوترکیب، جایگاه برش برای آنزیم‌های BamHI و XboI تعبیه شد. پلاسمید pET9a هم در جایگاه کلونینگ خود محل‌های برش برای این دو آنزیم را داشت. مواد موردنیاز برای انجام واکنش هضم آنزیمی شامل آب استریل (2 میکرولیتر)، بافر X10 (4 میکرولیتر)، آنزیم BamHI،1 میکرولیتر (unit/µl10)، آنزیم XboI، 2/1 میکرولیتر (unit/µl10)، پلاسمید و قطعه ژن، 12 میکرولیتر (1 ماکروگرم) بود. به‌منظور اطمینان از انجام واکنش هضم آنزیمی، نمونه‌ها بر روی ژل آگارز 5/1 درصد TBE برده شدند و از هر کدام از نمونه‌ها، یک کنترل نیز گذاشته شد (21).
با استفاده از روش آماری RSM، بررسی وضعیت بیان در OD (Optical Density) ها و غلظت‌های IPTG (Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside) مختلف، بهترین محیط کشت انتخاب گردید و ادامه کار با آن انجام شد. (تعداد نمونه‌ها توسط روش RSM تعیین شد) روش سطح پاسخ، اثرات مابین متغیرهای مستقل را به‌تنهایی یا در ترکیب با سایرین تعریف می‌نماید. به‌علاوه، این روش می‌تواند مدلی ریاضی که دقیقاً کل فرآیند را توصیف کند، را ایجاد نماید.
همچنین بهترین OD و مقدار IPTG نیز انتخاب گردید (جدول 1). برای این مرحله استوک Host Cell BL21 از فریزر 80- درجه سانتی‌گراد بیرون آورده شد و پس از هم دما شدن، مقدار 200 میکرولیتر از آن داخل یک لوله حاوی محیط LB broth (Luria-Bertan) ریخته و سپس مقدار 5 میکرولیتر (mg/L50) آنتی‌بیوتیک Kan (Kanamycin) به آن افزوده شد و به‌صورت overnight داخل شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با دور rpm 180 قرار گرفت. سپس پیش کشت به 100 میلی‌لیتر محیط LB دارای آنتی‌بیوتیک Kan اضافه شد و داخل شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. حال با توجه به OD و IPTG های نوشته‌شده در جدول 1 مرحله القاء انجام و پس از اضافه نمودن IPTG، 5 ساعت دیگر در شیکر انکوباتور با همان دما قرار داده شد. سپس محتویات کشت داده شده داخل یک فالکون استریل ریخته شد و در دور rpm 6500 و دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 14 دقیقه سانتریفیوژ گردید (23,22).
رومیپلاستیم یک پروتئین پیوندی و آنالوگ ترومبوپویتین است. ترومبوپویتین هورمونی است که تولید پلاکت را کنترل می‌کند. این دارو در درمان پورپورای ناشناس کاهش پلاکت توسط سازمان غذا و دارو آمریکا به‌منظور استفاده در مواردی از این بیماری که پاسخی به درمان‌های رایج همچون ایمونوگلوبولین وریدی، کورتون‌ها، تزریق روگام و جراحی طحال‌برداری نداده‌اند، تأیید شده است. رومیپلاستیم با استفاده از فن‌آوری DNA نوترکیب در E.coli تولید می‌شود و وزن مولکولی تقریبی آن نیز برابر 60 کیلو دالتون است (4-1). پیشرفت در مهندسی ژنتیک و پروتئین‌های نوترکیب مانند هر رشته علمی دیگر به در دسترس بودن تکنیک‌ها و روش‌هایی که دامنه و دقت آزمایش‌ها را گسترش می‌دهند، وابسته است (6,5). رومیپلاتسیم یک پپتیبادی است که شامل چهار اتصال TPO-R (Targeting Thrombopoietin receptor) است، دمین‌ها (شناسایی‌شده به‌وسیله غربالگری کتابخانه‌های جهش‌زایی پپتیدی) میل ترکیبی بالایی برای TPO-R (MPL (Myeloproliferative Protein Leukemia) و یک دمین حامل Fc (fragment crystallizable) دارند و با توالی با TPO درون‌زا همسانی ندارد، رومیپلاستیم به TPO-R روی پیش‌سازهای مگاکاریوسیت در مغز استخوان متصل می‌شود و آن را فعال می‌کند. به همان روش TPO درون‌زا متصل می‌شود و می‌تواند TPO را از گیرنده آن جابجا کند، رومیپلاستیم بسیاری از مسیرهای مشابه TPO را فعال می‌کند، که منجر به بهبود مستمر تعداد پلاکت‌ها با ادامه درمان در بیماران مبتلابه ITP (Immune Thrombocytopenic Purpura) می‌شود (7). تعامل با گیرنده‌های Fcγ ممکن است به رومیپلاتسیم اجازه دهد تا حفظ تحمل هومورال، بلوغ سلولی، ارائه آنتی‌ژن و گسترش سلول‌های T تنظیم‌کننده را اصلاح کند. درنهایت، رومیپلاتسیم ممکن است بتواند سلول‌های T تنظیم‌کننده را از طریق دو اپی توپ از ناحیه Fc به نام اپی‌توپ‌های تنظیمی T فعال کند. کاوش بیشتر در مورد این مکانیسم‌ها در عملکرد پپتی‌بادی‌ها ضروری است. اتصال رومیپلاستیم طیف وسیعی از مسیرهای سیگنالینگ را فعال می‌کند که زنده ماندن سلولی، رشد سلولی، اندومیتوز مگاکاریوسیتی، بلوغ مگاکاریوسیتی، و مهم‌تر از همه، تولید پلاکت را افزایش می‌دهد (7). رومیپلاستیم دامنه خارج سلولی TPO-R را فعال می‌کند، درحالی‌که الترومبوپاگ و اواترومبوپاگ (نوعی روش درمانی) بخش گذرنده TPO-R را فعال می‌کنند، که می‌تواند منجر به سطوح مختلف فعالیت TPO-R و درنتیجه پاسخ‌های متفاوت در بخش سلول‌های بنیادی و مگاکاریوسیت شود. داده‌های مختلف نشان می‌دهد که اتصال رومیپلاتسیم منجر به فسفوریلاسیون تیروزین و فعال شدن متعاقب آن مسیرهای سیگنالینگ پایین‌دستی Mp1، JAK2-STAT5، ERK1/2 و AKT می‌شود که منجر به رونویسی ژن و افزایش تکثیر مگاکاریوسیتی می‌گردد. مشابه با TPO درون‌زا، رومیپلاتسیم رشد سلول‌های تشکیل‌دهنده کلنی مگاکاریوسیت را تحریک می‌کند و تعداد مگاکاریوسیت‌ها، اندازه و پلوئیدی را افزایش می‌دهد. نقش کلات آهن داخل سلولی در اثر الترومبوپاگ منحصربه‌فرد است، اما تأثیر بالینی آن مشخص نیست. درمجموع، این ویژگی‌های رومیپلاتسیم دلایلی را روشن می‌کند که چرا یک گزینه درمانی خوب برای ITP (Immune thrombocytopenia) است و ممکن است در سایر شرایط هماتولوژیک که منجر به ترومبوسیتوپنی می‌شوند مفید باشد (9-7). رومیپلاستیم هم‌زمان با اریتروپویتین، فاکتور سلول‌های بنیادی IL-3 (Interleukin 3)، IL-6 (Interleukin 6) و GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) در تحریک رشد کلنی مگاکاریوسیت در شرایط آزمایشگاهی عمل می‌کند (10). فاکتورهای رشد خونی متعددی باعث تحریک تولید پلاکت‌ها ازجمله فاکتور محرک کلونی گرانولوسیت- ماکروفاژ (GM-CSF)، فاکتور سلول‌های بنیادی، اینترلوکین 1، اینترلوکین 3، اینترلوکین 6 و اینترلوکین 11 می‌شوند. برخی از این فاکتورهای رشد نشان می‌دهند که باعث افزایش تولید پلاکت در بیماران مبتلا به شیمی‌درمانی می‌شوند. اینترلوکین 11 در حال حاضر توسط غذا و داروی ایالات‌متحده برای درمان ترومبوسیتوپنی ناشی از شیمی‌درمانی تأیید شده است. نقش اصلی این عوامل تولید پلاکت نیست بلکه ترومبوپویتین فاکتور رشدی است که برای تولید پلاکت بسیار مهم است (13-11). با توجه به مزایای مولکول ترومبوپویتین نوترکیب انسانی، تلاش شد تا ترومبوپویتین جدیدی ایجاد شود که آنتی‌ژن نبوده و خواص دارویی را بهبود بخشد. در سال 1997، یک پپتید 14 آمینواسیدی شناسایی شد که هیچ‌گونه توالی مشترکی با ترومبوپویتین نداشت اما به گیرنده ترومبوپویتین متصل و آن را فعال می‌کرد. اتصال پیوند شیمیایی دو پپتید 14 اسید آمینه‌ایی در مقایسه با ترومبوپویتین نوترکیب باعث شد تا فعالیت آن ده هزار برابر افزایش پیدا کند (14). پپتید دایمر به علت دارا بودن دو سایت اتصال مختلف به رسپتور، می‌تواند مانند ترومبوپویتین درون‌زا به‌طور مؤثری به گیرنده ترومبوپوتین متصل و آن را فعال نماید. ترومبوپویتین پایدار و فعال با اتصال چهار پپتید حاوی 14 اسیدآمینه به پایانه کربوکسیل قطعه IgG1 Fc (Immunoglobulin G1) حاصل شد که درنهایت یک پلتفرم بیولوژیکی جدید به نام پپتیبادی ایجاد شد (16,15). فیاض و همکاران در مطالعه‌ای به بیان، خالص‌سازی و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پپتیبادی بیوسیملار رومیپلاستیم پرداختند. آن‌ها از یک سازه حاوی باکتری اشرشیاکلی ادغام‌شده با پپتیبادی استفاده نمودند (17).
با عنایت به اینکه تاکنون در خصوص بهینه‌سازی شرایط بیان ژن رومیپلاستیم مطالعه‌ای انجام نشده است، لذا مطالعه حاضر باهدف کلونینگ و بهینه‌سازی شرایط بیان ژن و خالص‌سازی پپتیبادی رومیپلاستیم نوترکیب در باکتری اشرشیا کلی انجام گردید.
مواد و روش کار
در این پژوهش کاربردی از باکتری (Escherichia coli) E.coli سویه BL21 برای بیان رومیپلاستیم استفاده شد. وکتور مورد استفاده در این مطالعه pET9a است. این وکتور دارای مارکر انتخابی کانامایسین و پروموتور T7 است. مراحل تهیه کشت بر اساس روش Zurawa-Janicka و همکاران (2017) انجام شد. به‌طور خلاصه، پس از تهیه LB broth، به آن سلول میزبان BL21 اضافه شد (18). برای استخراج پلاسمید از تک کلنی‌های کشت داده‌شده داخل پلیت با استفاده از لوپ برداشته شد و داخل محیط LB broth کشت داده و مقدار 5 میکرولیتر (mg/L 50) آنتی‌بیوتیک کانامایسین نیز اضافه گردید. سپس پلاسمید pET9a در مقیاس کوچک طبق دستورالعمل با کیت Thermo استخراج گردید. واکنش زنجیره پلی‌مراز (Polymerase Chain Reaction) در حجم 25 میکرولیتر شامل 75/12 میکرولیتر آب‌مقطر دو بار تقطیر، 5/2 میکرولیتر بافر واکنش x10، 5 /0 میکرولیتر مخلوط نوکلئوتیدی 10 میلی مولار، 5/0 میکرولیتر از هر دو پرایمر اختصاصی (10 پیکومول)، 5/0 میکرولیتر آنزیم تک پلی‌مراز (5 واحد/میکرولیتر) و 5 میکرولیتر DNA (50 نانوگرم) استفاده گردید. در این مطالعه از یک برنامه چرخه حرارتی به‌طور اختصاصی برای پرایمرها استفاده گردید. برای مرحله واسرشت اولیه دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه اعمال شد. تکثیر در 35 سیکل شامل 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 56 درجه به مدت 1 دقیقه و دمای گسترش 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 50 ثانیه صورت گرفت. یک سیکل نهایی شامل مرحله گسترش نهایی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه بود. محصول PCR در ژل اگارز 5/1 درصد TBE و با ولتاژ ثابت 80 ولت در 80 دقیقه الکتروفورز شد (19,20).
برای درج قطعه نوترکیب در پلاسمید، ابتدا لازم است که هم قطعه نوترکیب و هم پلاسمید به‌وسیله آنزیم‌های محدودگر یکسان، بریده شوند. برای انجام هضم آنزیمی در ابتدا و انتهای قطعه نوترکیب، جایگاه برش برای آنزیم‌های BamHI و XboI تعبیه شد. پلاسمید pET9a هم در جایگاه کلونینگ خود محل‌های برش برای این دو آنزیم را داشت. مواد موردنیاز برای انجام واکنش هضم آنزیمی شامل آب استریل (2 میکرولیتر)، بافر X10 (4 میکرولیتر)، آنزیم BamHI،1 میکرولیتر (unit/µl10)، آنزیم XboI، 2/1 میکرولیتر (unit/µl10)، پلاسمید و قطعه ژن، 12 میکرولیتر (1 ماکروگرم) بود. به‌منظور اطمینان از انجام واکنش هضم آنزیمی، نمونه‌ها بر روی ژل آگارز 5/1 درصد TBE برده شدند و از هر کدام از نمونه‌ها، یک کنترل نیز گذاشته شد (21).
با استفاده از روش آماری RSM، بررسی وضعیت بیان در OD (Optical Density) ها و غلظت‌های IPTG (Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside) مختلف، بهترین محیط کشت انتخاب گردید و ادامه کار با آن انجام شد. (تعداد نمونه‌ها توسط روش RSM تعیین شد) روش سطح پاسخ، اثرات مابین متغیرهای مستقل را به‌تنهایی یا در ترکیب با سایرین تعریف می‌نماید. به‌علاوه، این روش می‌تواند مدلی ریاضی که دقیقاً کل فرآیند را توصیف کند، را ایجاد نماید.
همچنین بهترین OD و مقدار IPTG نیز انتخاب گردید (جدول 1). برای این مرحله استوک Host Cell BL21 از فریزر 80- درجه سانتی‌گراد بیرون آورده شد و پس از هم دما شدن، مقدار 200 میکرولیتر از آن داخل یک لوله حاوی محیط LB broth (Luria-Bertan) ریخته و سپس مقدار 5 میکرولیتر (mg/L50) آنتی‌بیوتیک Kan (Kanamycin) به آن افزوده شد و به‌صورت overnight داخل شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با دور rpm 180 قرار گرفت. سپس پیش کشت به 100 میلی‌لیتر محیط LB دارای آنتی‌بیوتیک Kan اضافه شد و داخل شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. حال با توجه به OD و IPTG های نوشته‌شده در جدول 1 مرحله القاء انجام و پس از اضافه نمودن IPTG، 5 ساعت دیگر در شیکر انکوباتور با همان دما قرار داده شد. سپس محتویات کشت داده شده داخل یک فالکون استریل ریخته شد و در دور rpm 6500 و دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 14 دقیقه سانتریفیوژ گردید (23,22).
جدول (1): طراحی آزمایش مرحله اول با RSM
| فاکتور | سطح | ||
| IPTG (mM) | Host Cell | OD | |
| 5/0 | M9[1] | 4/0 | 1 |
| 1 | LB[2] | 8/0 | 2 |
| 5/1 | TB[3] | 2/1 | 3 |
| RSM با 3 فاکتور | |||
| Factor 3: IPTG | Factor 2: Host Cell | Factor 1: OD | Run |
| 5/0 | M9 | 4/0 | 1 |
| 5/1 | M9 | 4/0 | 2 |
| 1 | M9 | 8/0 | 3 |
| 5/0 | M9 | 2/1 | 4 |
| 5/1 | M9 | 2/1 | 5 |
| 1 | LB | 4/0 | 6 |
| 5/0 | LB | 8/0 | 7 |
| 5/1 | LB | 8/0 | 8 |
| 1 | LB | 8/0 | 9 |
| 1 | LB | 8/0 | 10 |
| 1 | LB | 8/0 | 11 |
| 1 | LB | 2/1 | 12 |
| 5/0 | TB | 4/0 | 13 |
| 5/1 | TB | 4/0 | 14 |
| 1 | TB | 8/0 | 15 |
| 5/1 | TB | 2/1 | 16 |
| 5/0 | TB | 2/1 | 17 |
استخراج پروتئین با استفاده از سانتریفیوژ، امواج اولتراسوند و بافر شستشو، SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis) و وسترن بلاتینگ با استفاده از مقاله ابراهیمی‌فرد و همکاران و طبق روش آن‌ها صورت گرفت (24). در انتها خالص‌سازی پروتئین نوترکیب انجام شد، رسوب حاصل از فرمنتیشن (اینکلوژن بادی) را در محلول حاوی گوانیدین 6 مولار، تریس 50 میلی مولار، DTT (Dithiothreitol) 8 میلی مولار با pH=8.7 به مدت یک ساعت حل گردید. سپس آن را در اوره 2 مولار، تریس 50 میلی مولار، آرژنین 160 میلی مولار، سیستئین 3 میلی مولار با pH=8.5، 20 برابر رقیق نموده و به مدت یک شب بر روی استیرر و در جای سرد قرار داده شد. حال محلول را در تریس 10 میلی مولار و اوره 5/1 مولار با pH=9 حل کرده و سپس آن را سانتریفیوژ و سوپرناتانت آن به ستون sp-سفارز لود شد و همراه آن از نمک 100 میلی مولار با pH=5 به‌صورت گرادیانت تا 500 میلی مولار استفاده گردید. (25).
یافته‌ها
توالی ژن و بهینه‌سازی کدونی:
توالی آمینواسیدی پیتیبادی رومیپلاستیم و توالی نوکلئوتیدی آن از پایگاه داده Drug bank (www.drugbank.ca) برداشته شد. برای اطمینان از بیان مطلوب ژن خارجی در باکتری، توالی ژنی بر اساس ترجیح کدونی بهینه‌سازی گردید. بهینه‌سازی بر اساس ترجیح کدونی، کدون دوتایی و ساختار دوم توالی mRNA (Messenger RNA) با استفاده از سایت Genescript انجام گرفت (http://www.genescript.com).
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGIEGPTLR
QWLAARAGGGGGGGGIEGPTLRQWLAARA
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGIEGPTLR
QWLAARAGGGGGGGGIEGPTLRQWLAARA
استخراج پلاسمید نوترکیب:
به‌منظور انجام واکنش الحاق ژن در ناقل، استخراج ناقل با استفاده از کیت استخراج ناقل شرکت Thermo انجام شد و درستی انجام عملیات استخراج با بارگذاری 7 میکرولیتر از ناقل استخراج شده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد بررسی و تأیید شد (شکل 1).
به‌منظور انجام واکنش الحاق ژن در ناقل، استخراج ناقل با استفاده از کیت استخراج ناقل شرکت Thermo انجام شد و درستی انجام عملیات استخراج با بارگذاری 7 میکرولیتر از ناقل استخراج شده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد بررسی و تأیید شد (شکل 1).
شکل (1): استخراج پلاسمید pET9a (1. مارکر 100 bp، 2 و 3. ناقل pET9a استخراج شده)
الکتروفورز محصول PCR برای تأیید استخراج پلاسمید:
نتیجه الکتروفورز محصول حاصل از PCR نشان داد که تکثیر قطعه حاوی ژن رومیپلاستیم به خوبی صورت پذیرفته و حضور قطعه تکثیر شده دارای اندازه 1008 جفت بازی، جای‌گیری ژن رومیپلاستیم در وکتور را تأیید می‌کند.
نتیجه الکتروفورز محصول حاصل از PCR نشان داد که تکثیر قطعه حاوی ژن رومیپلاستیم به خوبی صورت پذیرفته و حضور قطعه تکثیر شده دارای اندازه 1008 جفت بازی، جای‌گیری ژن رومیپلاستیم در وکتور را تأیید می‌کند.
شکل (2): الکتروفورز محصول PCR با استفاده از مارکر 100 جفت بازی. (2. مارکر 100 bp، 3. کنترل منفی، 4 و 5. پلاسمید pET9a به همراه ژن رومیپلاستیم)
بهینه‌سازی فرآیند بیان ژن رومیپلاستیم:
تجزیه و تحلیل رگرسیونی و واریانس (ANOVA) مشخص نمود که مدل چند جمله‌ای درجه‌ی دوم به اندازه کافی بیانگر پاسخ، با ضرایب مشخص می‌باشد. 9653/0= 2 R موید این است که مدل رگرسیون، واکنش را به‌خوبی توضیح داده و مدل برازش شده توانسته 53/96 درصد از کل تغییرات در دامنه‌ی مقادیر مورد مطالعه را توضیح دهد. 2R معیاری است برای اینکه مشخص گردد چه میزان از تغییرات توسط مدل شرح داده شده است و در موارد 2R واقعی و 2R تعدیل شده که به ترتیب 9653/0 و 9340/0 به‌دست آمدند، بیانگر توصیف مناسبی از پراکندگی داده‌ها بوده‌اند. همچنین مناسب بودن مدل با استفاده از آزمون فقدان برازش مورد بررسی قرار گرفت که در سطح 5 درصد معنی‌دار نبود (05/0 <P). از آنجا که فرض آزمون عدم برازش در معادله مدل معنی‌دار نبود؛ مدل بر اساس پارامترهای مختلف برازش گردید. برازش خوب به این معنی است که مدل ایجاد شده توانسته است که تغییرات در داده‌ها را به اندازه کافی توضیح دهد، لذا این مدل جهت پیش‌بینی در دامنه تعیین شده برای متغیرهای مورد استفاده مناسب بود. نمودارهای سه‌بعدی سطحی و کانتور برای متغیرها ترسیم شده است. هر شکل اثرات دو متغیر را روی پاسخ نمایش می‌دهند، که در هر نمودار متغیر سوم در میزان بهینه‌اش ثابت نگه‌داشته شده است.
انتخاب بهترین :OD
در این مرحله یکی از متغیرهای مستقل بیان رومیپلاستیم در سه OD مختلف (4/0، 8/0 و 2/1) با طول‌موج 600 نانومتر بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD (Central Composite Design برای پیش‌بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان رومیپلاستیم استفاده و با توجه به شکل 3 می‌توان بیان کرد که تغییرات غلظت میکروارگانیسم به‌طور معنی‌داری بر میزان بیان رومیپلاستیم تأثیر داشته است (05/0 <P). با توجه به شکل همان گونه که مشخص است، میزان بیان رومیپلاستیم هم راستا با افزایش غلظت میکروارگانیسم روند افزایشی داشته اما نمونه‌های حاوی غلظت 8/0 از میکروارگانیسم سبب بیشترین میزان بیان رومیپلاستیم شده همچنین کمترین میزان بیان رومیپلاستیم در نمونه‌های حاوی غلظت 4/0
میکروارگانیسم بوده است.
تجزیه و تحلیل رگرسیونی و واریانس (ANOVA) مشخص نمود که مدل چند جمله‌ای درجه‌ی دوم به اندازه کافی بیانگر پاسخ، با ضرایب مشخص می‌باشد. 9653/0= 2 R موید این است که مدل رگرسیون، واکنش را به‌خوبی توضیح داده و مدل برازش شده توانسته 53/96 درصد از کل تغییرات در دامنه‌ی مقادیر مورد مطالعه را توضیح دهد. 2R معیاری است برای اینکه مشخص گردد چه میزان از تغییرات توسط مدل شرح داده شده است و در موارد 2R واقعی و 2R تعدیل شده که به ترتیب 9653/0 و 9340/0 به‌دست آمدند، بیانگر توصیف مناسبی از پراکندگی داده‌ها بوده‌اند. همچنین مناسب بودن مدل با استفاده از آزمون فقدان برازش مورد بررسی قرار گرفت که در سطح 5 درصد معنی‌دار نبود (05/0 <P). از آنجا که فرض آزمون عدم برازش در معادله مدل معنی‌دار نبود؛ مدل بر اساس پارامترهای مختلف برازش گردید. برازش خوب به این معنی است که مدل ایجاد شده توانسته است که تغییرات در داده‌ها را به اندازه کافی توضیح دهد، لذا این مدل جهت پیش‌بینی در دامنه تعیین شده برای متغیرهای مورد استفاده مناسب بود. نمودارهای سه‌بعدی سطحی و کانتور برای متغیرها ترسیم شده است. هر شکل اثرات دو متغیر را روی پاسخ نمایش می‌دهند، که در هر نمودار متغیر سوم در میزان بهینه‌اش ثابت نگه‌داشته شده است.
انتخاب بهترین :OD
در این مرحله یکی از متغیرهای مستقل بیان رومیپلاستیم در سه OD مختلف (4/0، 8/0 و 2/1) با طول‌موج 600 نانومتر بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD (Central Composite Design برای پیش‌بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان رومیپلاستیم استفاده و با توجه به شکل 3 می‌توان بیان کرد که تغییرات غلظت میکروارگانیسم به‌طور معنی‌داری بر میزان بیان رومیپلاستیم تأثیر داشته است (05/0 <P). با توجه به شکل همان گونه که مشخص است، میزان بیان رومیپلاستیم هم راستا با افزایش غلظت میکروارگانیسم روند افزایشی داشته اما نمونه‌های حاوی غلظت 8/0 از میکروارگانیسم سبب بیشترین میزان بیان رومیپلاستیم شده همچنین کمترین میزان بیان رومیپلاستیم در نمونه‌های حاوی غلظت 4/0
میکروارگانیسم بوده است.
شکل (3): تاثیرات دانسیته نوری (OD) بر بیان رومیپلاستیم نسبت به سطح زیر منحنی پروتئین. نقاط قرمز سمت چپ پایین و سمت راست بالا بیانگر حداقل و حداکثر میزان OD برحسب Area می‌باشد و نقاط قرمز وسط تصویر مربوط به نقاط مرکزی و تکرار شونده است.
انتخاب بهترین غلظت القا کننده (IPTG):
در این مرحله یکی دیگر از متغیرهای مستقل بیان رومیپلاستیم در سه غلظت IPTG مختلف (5/0، 1 و 5/1 میلی مولار) بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغییر های مستقل بر میزان بیان رومیپلاستیم استفاده و با توجه به شکل 4 بهترین غلظت IPTG برای بیان رومیپلاستیم برابر با 1 میلی مولار می‌باشد که این ناحیه با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین به دست آمد.
در این مرحله یکی دیگر از متغیرهای مستقل بیان رومیپلاستیم در سه غلظت IPTG مختلف (5/0، 1 و 5/1 میلی مولار) بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغییر های مستقل بر میزان بیان رومیپلاستیم استفاده و با توجه به شکل 4 بهترین غلظت IPTG برای بیان رومیپلاستیم برابر با 1 میلی مولار می‌باشد که این ناحیه با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین به دست آمد.
شکل (4): تاثیرات غلظت IPTG بر بیان رومیپلاستیم نسبت به سطح زیر منحنی پروتئین
انتخاب بهترین محیط کشت:
فاکتورهای زیادی بر شرایط تخمیر مؤثر می‌باشند که می‌توانند بر رشد باکتری‌ها اثر بگذارند، یکی از آن‌ها نوع محیط کشت مورد استفاده می‌باشد. که ما در این مرحله از محیط کشت های LB, TB (Terrific Broth), M9 (Minimal Salts) که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان رومیپلاستیم استفاده نمودیم و با توجه به شکل 5 می‌توان بیان کرد که تغییرات محیط کشت به‌طور معنی‌داری بر میزان بیان رومیپلاستیم تأثیر داشته است (P<0.05). با توجه به شکل 5 همان گونه که مشخص است، میزان بیان رومیپلاستیم هم راستا با تغییر محیط کشت روند افزایشی داشته و نمونه‌های حاوی محیط کشت LB سبب بیشترین میزان بیان رومیپلاستیم شده همچنین کمترین میزان بیان رومیپلاستیم در محیط کشت M9 بوده است.
شکل (5): تأثیر محیط کشت بر بیان رومیپلاستیم نسبت به سطح زیر منحنی پروتئین
ارزیابی نقطه بهینه برای فرآیند بیان رومیپلاستیم:
پس از انجام آزمون‌های اولیه محدوده مناسبه متغیرهای مستقل تولید رومیپلاستیم شامل (میزان OD، غلظت IPTG و نوع محیط کشت) از روش سطح پاسخ (RSM) در قالب طرح مرکب مرکزی برای پیش‌بینی متغیرهای مستقل بر میزان تولید رومیپلاستیم استفاده شد (جدول 1). در بهینه‌سازی تولید رومیپلاستیم از 17 تیمار بر اساس طرح مرکب مرکزی، شامل 3 تکرار در نقطه مرکزی استفاده شد. متغیرهای مستقل مورد استفاده در این مرحله شامل میزان OD (4/0، 8/0 و 2/1) در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG (5/0، 1 و 5/1 میلی مولار) و نوع محیط کشت (TB, LB, M9). نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 8/0 در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 1 میلی‌مولار و نوع محیط کشت LB بود. همچنین پاسخ اندازه‌گیری شده شامل غلظت رومیپلاستیم با استفاده از سطح زیر منحنی پیک نمودار کروماتوگرام کروماتوگرافی مایع با فشار بالا بود. در روش سطح پاسخ برای هر پاسخی مدلی تعریف می‌شود که اثر مستقل و متقابل متغیرها را بر روی هر پاسخ بررسی می‌کند (جدول 2).
تجزیه واریانس برای ارزیابی اثرات معنی‌دار متغیرهای فرآیند بر روی پاسخ انجام شد. با انجام تجزیه و تحلیل ضریب همبستگی (R2) چند متغیره، مدل‌های مختلف بر اساس R2 واقعی و R2 پیش‌بینی شده مقایسه شد. به‌صورتی که مدلی که دارای بیشترین مقادیر این فاکتورها باشد دارای قدرت پیش‌بینی بالا و دقت بیشتری خواهد بود. آنالیز واریانس برای تعیین عدم برازش و معنی‌دار بودن اثرات خطی، درجه دوم و برهمکنش متغیرهای مستقل بر متغیرهای وابسته صورت گرفت. اگر مقدار P برای آزمون عدم برازش در جدول ANOVA کوچک‌تر مساوی 05/0 بود به معنای کافی بودن مدل برای پیش‌بینی پاسخ موردنظر می‌باشد. بی معنی بودن مقدار F در جدول ANOVA برای عدم برازش مطلوب است و به معنای مناسب بودن مدل برای داده‌های مشاهده شده است (جدول 3). درنهایت تیمار بهینه با توجه به نتایج پیش‌بینی می‌شود (جدول 4).
پس از انجام آزمون‌های اولیه محدوده مناسبه متغیرهای مستقل تولید رومیپلاستیم شامل (میزان OD، غلظت IPTG و نوع محیط کشت) از روش سطح پاسخ (RSM) در قالب طرح مرکب مرکزی برای پیش‌بینی متغیرهای مستقل بر میزان تولید رومیپلاستیم استفاده شد (جدول 1). در بهینه‌سازی تولید رومیپلاستیم از 17 تیمار بر اساس طرح مرکب مرکزی، شامل 3 تکرار در نقطه مرکزی استفاده شد. متغیرهای مستقل مورد استفاده در این مرحله شامل میزان OD (4/0، 8/0 و 2/1) در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG (5/0، 1 و 5/1 میلی مولار) و نوع محیط کشت (TB, LB, M9). نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 8/0 در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 1 میلی‌مولار و نوع محیط کشت LB بود. همچنین پاسخ اندازه‌گیری شده شامل غلظت رومیپلاستیم با استفاده از سطح زیر منحنی پیک نمودار کروماتوگرام کروماتوگرافی مایع با فشار بالا بود. در روش سطح پاسخ برای هر پاسخی مدلی تعریف می‌شود که اثر مستقل و متقابل متغیرها را بر روی هر پاسخ بررسی می‌کند (جدول 2).
تجزیه واریانس برای ارزیابی اثرات معنی‌دار متغیرهای فرآیند بر روی پاسخ انجام شد. با انجام تجزیه و تحلیل ضریب همبستگی (R2) چند متغیره، مدل‌های مختلف بر اساس R2 واقعی و R2 پیش‌بینی شده مقایسه شد. به‌صورتی که مدلی که دارای بیشترین مقادیر این فاکتورها باشد دارای قدرت پیش‌بینی بالا و دقت بیشتری خواهد بود. آنالیز واریانس برای تعیین عدم برازش و معنی‌دار بودن اثرات خطی، درجه دوم و برهمکنش متغیرهای مستقل بر متغیرهای وابسته صورت گرفت. اگر مقدار P برای آزمون عدم برازش در جدول ANOVA کوچک‌تر مساوی 05/0 بود به معنای کافی بودن مدل برای پیش‌بینی پاسخ موردنظر می‌باشد. بی معنی بودن مقدار F در جدول ANOVA برای عدم برازش مطلوب است و به معنای مناسب بودن مدل برای داده‌های مشاهده شده است (جدول 3). درنهایت تیمار بهینه با توجه به نتایج پیش‌بینی می‌شود (جدول 4).
جدول (2): بررسی اثر مستقل و متقابل متغیرها بر روی هر پاسخ
| Source | Sum of Squares | DF | Mean Square | F Value | Prob > F | |
| Mean | 7.696E+010 | 1 | 7.696E+010 | Suggested | ||
| Linear | 2.304E+009 | 3 | 7.680E+008 | 0.26 | 0.8543 | |
| 2FI | 1.638E+009 | 3 | 5.460E+008 | 0.15 | 0.9290 | |
| Quadratic | 2.486E+010 | 3 | 8.287E+009 | 4.76 | 0.0410 | Suggested |
| Cubic | 9.917E+009 | 4 | 2.479E+009 | 3.28 | 0.1785 | |
| Residual | 2.270E+009 | 3 | 7.567E+008 | |||
| Total | 1.179E+011 | 17 | 6.938E+009 | |||
جدول (3): ANOVA عدم برازش برای سطح پاسخ مدل
| Squares | Sum of Square | DF | Mean Square | F Value | Prob > F |
| Model | 2.880E+010 | 9 | 3.200E+009 | 1.84 | 0.2172 not significant |
| A | 6.650E+008 | 1 | 6.650E+008 | 0.38 | 0.5561 |
| B | 1.020E+009 | 1 | 1.020E+009 | 0.59 | 0.4691 |
| C | 6.194E+008 | 1 | 6.194E+008 | 0.36 | 0.5696 |
| A2 | 5.449E+005 | 1 | 5.449E+005 | 3.130E 004 | 0.9864 |
| B2 | 1.310E+010 | 1 | 1.310E+010 | 7.52 | 0.0288 |
| C2 | 5.144E+008 | 1 | 5.144E+008 | 0.30 | 0.6036 |
| AB | 9.710E+007 | 1 | 9.710E+007 | 0.056 | 0.8201 |
| AC | 8.482E+008 | 1 | 8.482E+008 | 0.49 | 0.5077 |
| BC | 6.926E+008 | 1 | 6.926E+008 | 0.40 | 0.5482 |
| Residual | 1.219E+010 | 7 | 1.741E+009 | ||
| Lack of Fit | 1.215E+010 | 5 | 2.429E+009 | 118.67 | 0.0084 significant |
| Pure Error | 4.094E+007 | 2 | 2.047E+007 | ||
| Cor Total | 4.099E+010 | 16 |
جدول (4): بهینه‌سازی تیمارها و پیشنهاد بهترین تیمار
| Solutions Number | OD | Medium | IPTG | Area | Desirability |
| 1 | 0.8 | 2.14 | 1 | 132270 | 0.760 Selected |
| 2 | 0.8 | 2.15 | 1.01 | 132269 | 0.760 |
| 3 | 0.8 | 2.14 | 1.02 | 132253 | 0.760 |
| 4 | 0.8 | 2.15 | 1.02 | 132251 | 0.760 |
| 5 | 0.8 | 2.16 | 1.03 | 131161 | 0.754 |
ارزیابی بیان رومیپلاستیم با استفاده از الکتروفورز:
باکتری ترانسفورم شده در حضور القا کننده بیان، کشت داده شد. قبل از افزودن IPTG یک نمونه به‌عنوان کنترل برداشته شد. پس از اتمام نمونه‌گیری استخراج پروتئین کل انجام گردید. 20 میکرولیتر از پروتئین استخراج شده پس از جوشاندن بر روی ژل SDS-PAGE الکتروفورز گردید که نتیجه آن در شکل 6 نشان داده شده است. وزن مولکولی رومیپلاستیم قبل از خالص‌سازی 30 کیلو دالتون می‌باشد. همچنین برای تأیید پروتئین موردنظر از تست وسترن بلاتینگ نیز استفاده گردید (شکل 7).
شکل (6): نتیجه الکتروفورز پروتئین کل استخراج شده از باکتری بر روی ژل SDS-PAGE. چاهک شماره 1 حاوی پروتئین نوترکیب رومیپلاستیم، چاهک شماره 2 کنترل منفی و M مارکر می‌باشد.
شکل (7): نتیجه تست وسترن بلاتینگ پس از مرحله خالص‌سازی و اتصال دو سیگنال پپتید به هم.
ارزیابی نقطه بهینه ازنظر HPLC:
بهترین نمونه بعد از مرحله استخراج پروتئین را ازنظر بررسی ژل SDS-PAGE به دستگاه HPLC تزریق نمودیم و نتیجه به‌صورت زیر حاصل گردید (شکل 8).
ارزیابی نقطه بهینه ازنظر HPLC:
بهترین نمونه بعد از مرحله استخراج پروتئین را ازنظر بررسی ژل SDS-PAGE به دستگاه HPLC تزریق نمودیم و نتیجه به‌صورت زیر حاصل گردید (شکل 8).
شکل (8): نتیجه تست وسترن بلاتینگ پس از مرحله خالص‌سازی و اتصال دو سیگنال پپتید به هم.
بحث و نتیجه‌گیری
پروتئین‌های نوترکیب، بخش قابل‌توجهی از داروهای بیوتکنولوژی تأیید شده توسط FDA (Food and Drug Administration) را تشکیل می‌دهند. پروتئین‌های درمانی با توجه به ویژگی‌هایشان مانند خلوص موفقیت بسیاری در درمان کسب کرده‌اند و این امر در درمان بیماری‌هایی که نیازمند جایگزینی پروتئین می‌باشند، درمان توسط هورمون بروز بیشتری دارد. همچنین دسترسی نامحدود به این پروتئین‌های درمانی موجب توسعه درمان بیماری‌های مرتبط شده است که نیازمند به کارگیری تکنولوژی نوترکیب در تولید در مقیاس صنعتی دارای بازده بالا و فاقد اثرات جانبی می‌باشد (27,26). موفقیت تجاری هر بایوفارماسوئیتیکال به قابلیت دستیابی به تولید در مقیاس زیاد و مقرون‌به‌صرفه آن محصول نوترکیب بستگی دارد. در نتیجه، هزینه تولید محصول نوترکیب می‌تواند با افزایش بازده تولید در مقیاس زیاد، به حداقل برسد و برای دستیابی به بازده بالا راهکارهایی ازجمله استفاده از میزبان مناسب، وکتور مطلوب، فرآیند افزایش مقیاس و همچنین فرآیند تخلیص آسان و ارزان ضروری می‌باشد (28).
پروتئین‌ها در بدن دارای نقش بسیار مهم و گسترده‌ای در فرآیندهای زیستی، از قبیل انتقال مواد به درون سلول‌ها و بیرون از آن، تشکیل رسپتورها، تسریع واکنش‌های بیوشیمیایی و فرآیند سیگنالینگ هستند. برای مطالعات پزشکی استفاده از پروتئین‌های نوترکیب به‌صورت محلول بسیار مورد استفاده قرار گرفته و پروتئین‌های نوترکیب نسبت به سایر پروتئین‌ها دارای مزیت‌هایی هستند. یکی از این مزیت‌ها آن است که نسخه کپی شده و بازنویسی شده از ژن انسانی می‌تواند همانند پروتئین طبیعی بدن به‌طور اختصاصی عمل نماید. همچنین پروتئین‌های نوترکیب به‌طور موثرتر و با هزینه کمتر و با فراوانی بیشتری تولید می‌شوند (29). از طرفی تولید پروتئین در سیستم‌های پروکاریوتی محدودیت‌های جدی نیز به همراه دارد، فرآورده‌های حاصل به‌طور محسوسی با فرآورده‌های طبیعی انسانی اختلاف دارند. زیرا باکتری‌ها فاقد امکانات سلول‌های یوکاریوتی جهت انجام اصطلاحات پس از ترجمه که شامل فسفریلاسیون و گلیکوزیلاسیون در پروتئین‌ها می‌باشد، هستند (30). فقدان مکانیسم ترشحی مؤثر به محیط کشت معایب اصلی سیستم E.coli به‌عنوان یک سیستم بیان کننده می‌باشد. همچنین ممکن است عدم بیان پروتئین و بیان به میزان کم به دلیل سمیت پروتئین یا ارجحیت کدونی یا عدم شکل‌گیری صحیح باندهای دی‌سولفیدی در این سیستم رخ دهد. از طرفی شکل‌گیری اینکلوژن بادی نیز باعث تا شدن نادرست و حلالیت پایین پروتئین‌ها می‌شود که نیاز به تجهیزاتی می‌باشد تا بتوان آن‌ها را به‌صورت محلول درآورد، به همین دلیل برای برخی پروتئین‌های یوکاریوتی که در آن‌ها تغییرات پس از ترجمه نیاز می‌باشد، استفاده از سیستم بیانی E.coli مناسب نخواهد بود، اما ما در این مطالعه رومیپلاستیم را با استفاده از فن‌آوری DNA نوترکیب در E. coli به‌صورت اینکلوژن بادی با وزن مولکولی تقریبی برابر 59 کیلو دالتون تولید نمویم، از دلایل انتخاب این میزبان، رشد سریع باکتری، هزینه کم و بیان قابل قبول در مدت‌زمان کوتاه و توانایی رشد سریع بر سوبستراهای ارزان و بسیاری از ابزارهای مولکولی، نام برد. البته برخی از پژوهشگران سیستم‌های بیانی یوکاریوتی را انتخاب می‌کنند، پروتئین‌های یوکاریوتی اغلب دارای پیوندهای دی‌سولفید هستند که در فولد شدن درست پروتئین، پایداری و فعالیت آن ضروری هستند. به دلیل ویژگی‌های پروتئین‌های دارای باند دی‌سولفید اغلب پروتئین‌های دارویی نیز دارای باند دی‌سولفید هستند بنابراین دستیابی به سیستم‌های گوناگون بیانی که بتوانند پروتئین‌های حاوی پیوندهای دی سولفید را به درستی با سرعت و بهره وری بالا و ارزان قیمت تولید کنند ضروری است. سیستم‌های گوناگونی جهت بیان پروتئین‌های دارای باند دی‌سولفید توسعه یافته‌اند که هر یک مزایا و معایب خود را دارند برای مثال سیستم‌های بیانی یوکاریوت نظیر سلول‌های تخمدان همستر، مخمر یا سلول‌های حشرات ظرفیت بیان پروتئین‌های پیچیده حاوی چندین پیوند دی‌سولفید را دارند اما بسیار کند و گران قیمت هستند. سیستم‌های بیانی بدون سلول نیز اگر چه مشکل سرعت را حل می‌کنند ولی برای مقیاس‌های زیاد مناسب نیستند، در نتیجه سیستم‌های بیانی پروکاریوت با بهره‌وری و سرعت بالا و قیمت پایین مناسب‌ترین گزینه برای بیان پروتئین‌های نوترکیب هستند و در این بین اشریشیاکلی عمومی‌ترین گزینه بود. چانگ و همکاران در سال 2012، در مطالعه‌ای به تولید صنعتی داروهای نوترکیب در اشرشیاکلی و پیشرفتهای اخیر آن پرداختند. نزدیک به 30 درصد از پروتئین‌های درمانی نوترکیب تأیید شده در حال حاضر در اشرشیاکلی تولید می‌شود. با توجه به ژنتیک مشخص، رشد سریع و تولید پر بازده، اشرشیاکلی یک انتخاب ارجح برای بیان پروتئین‌های غیر گلیکوزیله در صنعت بیوتکنولوژی بوده است و از دلایل انتخاب این پژوهش می‌باشد، در نتیجه بیان و خالص‌سازی یک پروتئین نوترکیب از E.coli می‌تواند سریعتر، ارزان‌تر و آسان‌تر از ارگانیسم‌های دیگر باشد (32-30).
در این پژوهش رومیپلاستیم با موفقیت در باکتری E.coli تولید شد. رومیپلاستیم یک پروتئین فیوژن Fc پپتید دیمر (پپتیبادی) تحریک کننده ترومبوپویز برای افزایش تولید پلاکت از طریق فعال شدن گیرنده ترومبوپویتین است این مولکول دارای دو زیر واحد تک زنجیره‌ای است که هر یک از آن‌ها از 269 اسید آمینه تشکیل شده است. هر زیر واحد شامل یک دمین حامل IgG1 Fc است که به‌صورت کووالانسی به یک توالی پلی پپتیدی متصل شده است که شامل دو دمین اتصالی برای واکنش با گیرنده ترومبوپویتین c-Mpl است. هر دمین از 14 اسید آمینه تشکیل شده است (33). فیاض و همکاران در سال 2016، در مطالعه‌ای به بیان، خالص‌سازی و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پپتیبادی بیوسیملار رومیپلاستیم پرداختند. آن‌ها از یک سازه حاوی باکتری اشرشیاکلی ادغام شده با پپتیبادی استفاده نمودند. این سازه شامل دو ترکیب پپتیدی تکراری که با گروه کربوکسیل IgG1Fc ترکیب شده، می‌باشند. این سازه در باکتری اشرشیاکلی منجر به بیان پروتئین به‌عنوان انکلوژن بادی گردید. انکلوژن بادی‌ها شکسته، شسته و پس از دناتوره و حل شدن، در مرحله آخر پپتی‌بادی‌های موردنظر مجدد تا شده و خالص‌سازی شد. پپتی‌بادی‌های به دست آمده با تکنیک SDS-PAGE و وسترن ایمونوبلاتینگ تأیید شدند. فعالیت زیستی آن به‌صورت تزریق زیر جلدی در موش بررسی گردید. نتایج آن‌ها نشان داد که مولکول‌ها به‌طور صحیح تولید و خالص شده‌اند و آزمایش in vivo از افزایش معنی‌دار پلاکت‌ها نسبت به گروه کنترل خبر داد (17) اینکلوژن بادی اجسام انکلوژنی هستند که در تولید پروتئین‌های نوترکیب به دلیل جمع شدن جزئی و تاخوردگی نامناسب به‌صورت بسته‌های کوچک در داخل دیواره باکتری‌ها جای گرفته‌اند. در این مطالعه هم پروتئین رومیپلاستیم به‌صورت اینکلوژن بادی بیان شد، و ازآنجایی‌که پروتئین‌هایی که به‌صورت اینکلوژن بادی هستند، انجام ریفولد و ایجاد فرم native پروتئین که فعالیت داشته باشد، اهمیت فراوانی دارد. سپس نمونه‌های پروتئینی استخراج شده پس از انجام SDS-PAGE روی کاغذ نیتروسلولز لکه گذاری شدند. نقاط غیر اختصاصی موجود بر روی کاغذ توسط بافر، بلوکه شدند. پس از انجام سه مرحله شستشو، آنتی بادی مونوکلونال اولیه ضد رومیپلاستیم و سپس آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم HRP (Horseradish peroxidase) مورد استفاده قرار گرفت. تأیید نهایی آن توسط آزمایش وسترن بلاتینگ صورت پذیرفت. پس از انجام مراحل وسترن بلاتینگ، باند پروتئینی در ناحیه حدود 45 کیلودالتون مشاهده‌گردید که تأیید کننده نهایی تولید پروتئین تولید شده توسط باکتری E.coli BL21(DE3) در این مطالعه بود.
در مطالعه حال حاضر، بهینه‌سازی مرحله خالص‌سازی پروتئین رومیپلاستیم، پارامترهای Optical Density(OD)، IPTG و محیط کشت از روش آماری RSM استفاده شد، برای القا باکتری‌ها، به‌منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب از غلطت‌های مختلف IPTG استفاده شد، زیرا بیان ژن‌های مختلف در غلظت‌های متفاوت از IPTG صورت گرفته است. در این پژوهش از غلظت‌های 5/0، 1 و 5/1 میلی مولار IPTG برای القا در مدت‌زمان 5 ساعت استفاده شد. که در اکثر تحقیقات از غلظت یک میلی‌مولار برای القا استفاده شده بود (35,34). از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغیرهای مستقل بر میزان بیان پروتئین رومیپلاستیم استفاده و نتیجه این گونه شد که بهترین غلظت IPTG برای بیان این پروتئین برابر با 1 میلی‌مولار می‌باشد که این ناحیه با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین به دست آمد. که همراستا با نتایج دیگر همکاران بود. در این مطالعه یکی از متغیرهای مستقل بیان پروتئین رومیپلاستیم در سه OD مختلف (4/0، 8/0 و 2/1) با طول‌موج 600 نانومتر بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM بر میزان بیان پروتئین رومیپلاستیم استفاده گردید و بیان شد که تغییرات غلظت میکروارگانیسم به‌طور معنی‌داری بر میزان بیان رومیپلاستیم تأثیر داشته است. (P<0.05) نمونه‌های حاوی غلظت 8/0 از میکروارگانیسم سبب بیان بیشترین میزان رومیپلاستیم شده همچنین کمترین میزان بیان رومیپلاستیم در نمونه‌های حاوی غلظت 4/0 میکروارگانیسم بوده است. همچنین ما در این مرحله از محیط کشت‌های LB, TB, M9 که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان پروتئین رومیپلاستیم استفاده نمودیم و بهترین محیط کشت برای بیان رومیپلاستیم، محیط کشت LB بود. این محیط کشت با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین به دست آمد. عبدالله زاده و همکاران در سال 2020 در مطالعه‌ای برای بهینه‌سازی تولید آنزیم پکتینار از روش آماری RSM نیز استفاده نمودند. متغیرهای مورد بررسی به این روش پکتین، زمان انکوباسیون، آمونیوم کلراید و دی پتاسیم فسفات بودند که برای تولید بهینه آنزیم مورد استفاده قرار گرفتند. بهینه‌سازی پکتین (به‌عنوان القا کننده آنزیم پکتیناز) تولید آنزیم را بیش از سایر موارد، افزایش داد. از طرف دیگر، آمونیوم کلراید (به‌عنوان منبع نیتروژن) نقش مهمی در کاهش تولید پکتیناز در حضور نیتروژن آلی داشت. در آخر آن‌ها به این نتیجه رسیدند که استفاده از روش RSM برای بهینه‌سازی تولید آنزیم مؤثر بوده و تولید آنزیم را تقریباً 12 برابر افزایش داد (از U/mg 16/1 به U/mg 16/14 رساند)(36). همچنین ابراهیمی فرد و همکاران در سال 2022، بیان ژن انتروکیناز انسانی در سه سویه از سیستم باکتریایی E.coli بنام‌های BL21، Shuffle T7 و NICO21، انواع غلظت IPTG و بیان آنزیم را در OD های مختلف از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغیرهای مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده نمودند و به این نتایج دست یافتند که نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 2/1 در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 72/0 میلی‌مولار و نوع سویه باکتری ShuffleT7 بود که بیشترین بیان آنزیم مشاهده‌گردید (24). که در این مطالعه نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 8/0 در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 1 میلی‌مولار و نوع محیط کشت LB برای بیان بیشتر پروتئین رومیپلاستیم حاصل شد. پکی‌ام و همکاران در سال 2020 در مطالعه‌ای به بهینه‌سازی تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی با استفاده از رویکردهای محاسباتی و تجربی پرداختند. آن‌ها معتقد بودند که کاربرد همه روش‌های بهینه‌سازی به ترتیب برای همه فاکتورهای حیاتی در سطح بیان و فرآیند می‌تواند منجر به بازده بالای پروتئین نوترکیب شود (37) که در این مطالعه نیز استفاده از روش RSM به‌عنوان ابزارهای محاسباتی مناسب از ویژگی‌های تاثیرگذار است که بهینه‌سازی عوامل مبتنی بر ژن و پروتئین، شناسایی سطوح بهینه تمام فاکتورهای فرآیندی انتخابی را تسهیل می‌کند. در نتیجه چنین سیستم پیشرفتهای قادر به پیش‌بینی عملکرد پروتئین در اشرشیاکلی نوترکیب بوده و آزمایشات آزمایشگاهی را بیشتر کاهش خواهد داد.
پوری در سال 2022 به اتفاق همکاران، طراحی کیفیت فرایند پروسه خالص‌سازی رومیپلاستیم را مورد بررسی قرار دادند. آن‌ها با در نظر گرفتن سه پارامتر pH، زمان انکوباسیون و نسبت سیستین/ سیستئین در مرحله ریفولد بهینه‌سازی انجام دادند. آن‌ها دست یافتند که در pH قلیایی افزایش پیوند دی سولفیدی بیشتر بوده و روی تاخوردگی مجدد پروتئین تأثیر مثبت خواهد داشت. نتایج آن‌ها اینگونه بود که با pH=8، نسبت سیستین به سیستئین 5/0 و زمان انکوباسیون 72 ساعت، بازده تاخوردگی مجدد پروتئین به 85 درصد رساندند و برای حذف ناخالصی‌ها از کروماتوگرافی HIC استفاده نمودند (38). نتایج مطالعه ما اینگونه بود که پس از تولید و جدا سازی IB از باکتری‌های نوترکیب، در اوره ۸ مولار و DTT حل شد و در حضور افزودنی‌های آرژنین، سوربیتول، تریس ریفولد شدند. نتایج بهینه Refolding در pH 6 و نسبت 1 سیستین به سیستئین و DTT 10 میلی مولار حاصل شد. خالص‌سازی را بر اساس patent Amgen با رزین Sp sepharose انجام شد. هاشم‌زایی و همکاران در سال 2023، در مطالعه‌ای با عنوان بیان پروتئین و خالص‌سازی رومیپلاستیم و تجزیه و تحلیل تولید ترشحی آن با استفاده از شبیه سازی و بررسی سیگنال پپتید آن در باکتری اشرشیاکلی، آن‌ها توالی نوکلئوتیدی رومیپلاستیم را برای بیان در سویه BL21 بهینه و برای تجزیه و تحلیل اثر سیگنال پپتید pelB از پلاسمیدهای pET-22b(+) و pET-15b استفاده نمودند (39). که پلاسمید مورد استفاده این مطالعه از نوع pET9a است. این وکتور دارای مارکر انتخابی کانامایسین و پروموتر T7 می‌باشد که از پلاسمید دیگری استفاده شد. رضوی‌پور و همکاران در سال 2022، در مطالعه‌ای با عنوان نقش مهار آنزیم فورمات دهیدروژناز در رشد باکتری صنعتی BL21، با بررسی مسیرهای متابولیکی مستند شده در وبگاه KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) با دیدگاه کاهش راندمان تولید CO2 از اسید فرمیک بررسی نمودند. نتایج آن‌ها نشان داد در محیط LB، موتان باکتری‌های اشرشیاکلی نسبت به BL21 از رشد بیشتری برخوردارند، که این تفاوت در محیط M9 بارزتر بود (40). در این مطالعه نیز در محیط کشت LB بیشترین بیان پروتئین رومیپلاستیم نسبت به M9 مشاهده‌گردید. رانا و همکاران در سال 2023 در مطالعه‌ای به بررسی ریفولدینگ پروتئین رومیپلاستیم با استفاده از گروماتوگرافی پرداختند. آن‌ها به این نتیجه دست یافتند که ریفولدینگ مجدد در شرایط بهینه، حداکثر بازده را 5/1 ± 57 درصد و خلوص بیش از 4/3 ± 73/79 درصد در رقت 25 برابری در دمای 15 درجه سانتی‌گراد می‌دهد (41). در این مطالعه نیز ما از فرآیند ریفولدینگ برای بازده بیشتر و خالص‌سازی بهتر استفاده نمودیم.
نتیجه‌گیری
در این مطالعه کلونینگ و بهینه‌سازی شرایط بیان ژن و خالص‌سازی پپتیبادی رومیپلاستیم در سویه BL21 از باکتری اشرشیا کلی صورت گرفت. بهترین OD برای بیان رومیپلاستیم 8/0، بهترین غلظت IPTG که بیشترین بیان را برای رومیپلاستیم فراهم نمود، غلظت 1 میلی‌مولار و بهترین محیط کشت مورد بررسی در این مطالعه، محیط کشت LB بود. همچنین برای شروع فرآیند خالص‌سازی ابتدا مرحله ریفولدینگ صورت گرفت، به دلیل اینکه پروتئین به نحو صحیح فولد گردد، در ادامه از ستون‌های sp-sepharose برای اتمام مراحل خالص‌سازی استفاده گردید. با استفاده از نتایج چنین تحقیقاتی، پروتئین‌های نوترکیب در مقیاس وسیع و با خلوص زیاد (تولید صنعتی)، تولید خواهد شد که می‌تواند منجر به خودکفایی در صنعت داروسازی نوترکیب شود. از کاربردهای بالینی داروی رومیپلاستیم می‌توان به کنترل پلاکت در بیماران مبتلا به اختلالات پلاکتی اشاره نمود. همچنین پیشنهاد می‌گردد برای تولید انواع پروتئین‌های نوترکیب حتماً از روش‌های بهینه‌سازی برای فاکتورهای OD، IPTG، محیط کشت و سلول میزبان استفاده گردد.
تشکر و قدردانی
از شرکت تحقیقاتی تولیدی آریا تینا ژن به خاطر فراهم نمودن امکانات و تجهیزات مناسب جهت انجام این مطالعه تقدیر و تشکر می‌گردد.
حمایت مالی
این مطالعه تحت حمایت مالی شرکت تحقیقاتی تولیدی آریا تینا ژن انجام شده است.
تعارض منافع
نویسندگان اعلام می‌کنند که هیچ‌گونه تعارض منافعی وجود ندارد.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه هیچ‌گونه ملاحظه اخلاقی ندارد.
پروتئین‌های نوترکیب، بخش قابل‌توجهی از داروهای بیوتکنولوژی تأیید شده توسط FDA (Food and Drug Administration) را تشکیل می‌دهند. پروتئین‌های درمانی با توجه به ویژگی‌هایشان مانند خلوص موفقیت بسیاری در درمان کسب کرده‌اند و این امر در درمان بیماری‌هایی که نیازمند جایگزینی پروتئین می‌باشند، درمان توسط هورمون بروز بیشتری دارد. همچنین دسترسی نامحدود به این پروتئین‌های درمانی موجب توسعه درمان بیماری‌های مرتبط شده است که نیازمند به کارگیری تکنولوژی نوترکیب در تولید در مقیاس صنعتی دارای بازده بالا و فاقد اثرات جانبی می‌باشد (27,26). موفقیت تجاری هر بایوفارماسوئیتیکال به قابلیت دستیابی به تولید در مقیاس زیاد و مقرون‌به‌صرفه آن محصول نوترکیب بستگی دارد. در نتیجه، هزینه تولید محصول نوترکیب می‌تواند با افزایش بازده تولید در مقیاس زیاد، به حداقل برسد و برای دستیابی به بازده بالا راهکارهایی ازجمله استفاده از میزبان مناسب، وکتور مطلوب، فرآیند افزایش مقیاس و همچنین فرآیند تخلیص آسان و ارزان ضروری می‌باشد (28).
پروتئین‌ها در بدن دارای نقش بسیار مهم و گسترده‌ای در فرآیندهای زیستی، از قبیل انتقال مواد به درون سلول‌ها و بیرون از آن، تشکیل رسپتورها، تسریع واکنش‌های بیوشیمیایی و فرآیند سیگنالینگ هستند. برای مطالعات پزشکی استفاده از پروتئین‌های نوترکیب به‌صورت محلول بسیار مورد استفاده قرار گرفته و پروتئین‌های نوترکیب نسبت به سایر پروتئین‌ها دارای مزیت‌هایی هستند. یکی از این مزیت‌ها آن است که نسخه کپی شده و بازنویسی شده از ژن انسانی می‌تواند همانند پروتئین طبیعی بدن به‌طور اختصاصی عمل نماید. همچنین پروتئین‌های نوترکیب به‌طور موثرتر و با هزینه کمتر و با فراوانی بیشتری تولید می‌شوند (29). از طرفی تولید پروتئین در سیستم‌های پروکاریوتی محدودیت‌های جدی نیز به همراه دارد، فرآورده‌های حاصل به‌طور محسوسی با فرآورده‌های طبیعی انسانی اختلاف دارند. زیرا باکتری‌ها فاقد امکانات سلول‌های یوکاریوتی جهت انجام اصطلاحات پس از ترجمه که شامل فسفریلاسیون و گلیکوزیلاسیون در پروتئین‌ها می‌باشد، هستند (30). فقدان مکانیسم ترشحی مؤثر به محیط کشت معایب اصلی سیستم E.coli به‌عنوان یک سیستم بیان کننده می‌باشد. همچنین ممکن است عدم بیان پروتئین و بیان به میزان کم به دلیل سمیت پروتئین یا ارجحیت کدونی یا عدم شکل‌گیری صحیح باندهای دی‌سولفیدی در این سیستم رخ دهد. از طرفی شکل‌گیری اینکلوژن بادی نیز باعث تا شدن نادرست و حلالیت پایین پروتئین‌ها می‌شود که نیاز به تجهیزاتی می‌باشد تا بتوان آن‌ها را به‌صورت محلول درآورد، به همین دلیل برای برخی پروتئین‌های یوکاریوتی که در آن‌ها تغییرات پس از ترجمه نیاز می‌باشد، استفاده از سیستم بیانی E.coli مناسب نخواهد بود، اما ما در این مطالعه رومیپلاستیم را با استفاده از فن‌آوری DNA نوترکیب در E. coli به‌صورت اینکلوژن بادی با وزن مولکولی تقریبی برابر 59 کیلو دالتون تولید نمویم، از دلایل انتخاب این میزبان، رشد سریع باکتری، هزینه کم و بیان قابل قبول در مدت‌زمان کوتاه و توانایی رشد سریع بر سوبستراهای ارزان و بسیاری از ابزارهای مولکولی، نام برد. البته برخی از پژوهشگران سیستم‌های بیانی یوکاریوتی را انتخاب می‌کنند، پروتئین‌های یوکاریوتی اغلب دارای پیوندهای دی‌سولفید هستند که در فولد شدن درست پروتئین، پایداری و فعالیت آن ضروری هستند. به دلیل ویژگی‌های پروتئین‌های دارای باند دی‌سولفید اغلب پروتئین‌های دارویی نیز دارای باند دی‌سولفید هستند بنابراین دستیابی به سیستم‌های گوناگون بیانی که بتوانند پروتئین‌های حاوی پیوندهای دی سولفید را به درستی با سرعت و بهره وری بالا و ارزان قیمت تولید کنند ضروری است. سیستم‌های گوناگونی جهت بیان پروتئین‌های دارای باند دی‌سولفید توسعه یافته‌اند که هر یک مزایا و معایب خود را دارند برای مثال سیستم‌های بیانی یوکاریوت نظیر سلول‌های تخمدان همستر، مخمر یا سلول‌های حشرات ظرفیت بیان پروتئین‌های پیچیده حاوی چندین پیوند دی‌سولفید را دارند اما بسیار کند و گران قیمت هستند. سیستم‌های بیانی بدون سلول نیز اگر چه مشکل سرعت را حل می‌کنند ولی برای مقیاس‌های زیاد مناسب نیستند، در نتیجه سیستم‌های بیانی پروکاریوت با بهره‌وری و سرعت بالا و قیمت پایین مناسب‌ترین گزینه برای بیان پروتئین‌های نوترکیب هستند و در این بین اشریشیاکلی عمومی‌ترین گزینه بود. چانگ و همکاران در سال 2012، در مطالعه‌ای به تولید صنعتی داروهای نوترکیب در اشرشیاکلی و پیشرفتهای اخیر آن پرداختند. نزدیک به 30 درصد از پروتئین‌های درمانی نوترکیب تأیید شده در حال حاضر در اشرشیاکلی تولید می‌شود. با توجه به ژنتیک مشخص، رشد سریع و تولید پر بازده، اشرشیاکلی یک انتخاب ارجح برای بیان پروتئین‌های غیر گلیکوزیله در صنعت بیوتکنولوژی بوده است و از دلایل انتخاب این پژوهش می‌باشد، در نتیجه بیان و خالص‌سازی یک پروتئین نوترکیب از E.coli می‌تواند سریعتر، ارزان‌تر و آسان‌تر از ارگانیسم‌های دیگر باشد (32-30).
در این پژوهش رومیپلاستیم با موفقیت در باکتری E.coli تولید شد. رومیپلاستیم یک پروتئین فیوژن Fc پپتید دیمر (پپتیبادی) تحریک کننده ترومبوپویز برای افزایش تولید پلاکت از طریق فعال شدن گیرنده ترومبوپویتین است این مولکول دارای دو زیر واحد تک زنجیره‌ای است که هر یک از آن‌ها از 269 اسید آمینه تشکیل شده است. هر زیر واحد شامل یک دمین حامل IgG1 Fc است که به‌صورت کووالانسی به یک توالی پلی پپتیدی متصل شده است که شامل دو دمین اتصالی برای واکنش با گیرنده ترومبوپویتین c-Mpl است. هر دمین از 14 اسید آمینه تشکیل شده است (33). فیاض و همکاران در سال 2016، در مطالعه‌ای به بیان، خالص‌سازی و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پپتیبادی بیوسیملار رومیپلاستیم پرداختند. آن‌ها از یک سازه حاوی باکتری اشرشیاکلی ادغام شده با پپتیبادی استفاده نمودند. این سازه شامل دو ترکیب پپتیدی تکراری که با گروه کربوکسیل IgG1Fc ترکیب شده، می‌باشند. این سازه در باکتری اشرشیاکلی منجر به بیان پروتئین به‌عنوان انکلوژن بادی گردید. انکلوژن بادی‌ها شکسته، شسته و پس از دناتوره و حل شدن، در مرحله آخر پپتی‌بادی‌های موردنظر مجدد تا شده و خالص‌سازی شد. پپتی‌بادی‌های به دست آمده با تکنیک SDS-PAGE و وسترن ایمونوبلاتینگ تأیید شدند. فعالیت زیستی آن به‌صورت تزریق زیر جلدی در موش بررسی گردید. نتایج آن‌ها نشان داد که مولکول‌ها به‌طور صحیح تولید و خالص شده‌اند و آزمایش in vivo از افزایش معنی‌دار پلاکت‌ها نسبت به گروه کنترل خبر داد (17) اینکلوژن بادی اجسام انکلوژنی هستند که در تولید پروتئین‌های نوترکیب به دلیل جمع شدن جزئی و تاخوردگی نامناسب به‌صورت بسته‌های کوچک در داخل دیواره باکتری‌ها جای گرفته‌اند. در این مطالعه هم پروتئین رومیپلاستیم به‌صورت اینکلوژن بادی بیان شد، و ازآنجایی‌که پروتئین‌هایی که به‌صورت اینکلوژن بادی هستند، انجام ریفولد و ایجاد فرم native پروتئین که فعالیت داشته باشد، اهمیت فراوانی دارد. سپس نمونه‌های پروتئینی استخراج شده پس از انجام SDS-PAGE روی کاغذ نیتروسلولز لکه گذاری شدند. نقاط غیر اختصاصی موجود بر روی کاغذ توسط بافر، بلوکه شدند. پس از انجام سه مرحله شستشو، آنتی بادی مونوکلونال اولیه ضد رومیپلاستیم و سپس آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم HRP (Horseradish peroxidase) مورد استفاده قرار گرفت. تأیید نهایی آن توسط آزمایش وسترن بلاتینگ صورت پذیرفت. پس از انجام مراحل وسترن بلاتینگ، باند پروتئینی در ناحیه حدود 45 کیلودالتون مشاهده‌گردید که تأیید کننده نهایی تولید پروتئین تولید شده توسط باکتری E.coli BL21(DE3) در این مطالعه بود.
در مطالعه حال حاضر، بهینه‌سازی مرحله خالص‌سازی پروتئین رومیپلاستیم، پارامترهای Optical Density(OD)، IPTG و محیط کشت از روش آماری RSM استفاده شد، برای القا باکتری‌ها، به‌منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب از غلطت‌های مختلف IPTG استفاده شد، زیرا بیان ژن‌های مختلف در غلظت‌های متفاوت از IPTG صورت گرفته است. در این پژوهش از غلظت‌های 5/0، 1 و 5/1 میلی مولار IPTG برای القا در مدت‌زمان 5 ساعت استفاده شد. که در اکثر تحقیقات از غلظت یک میلی‌مولار برای القا استفاده شده بود (35,34). از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغیرهای مستقل بر میزان بیان پروتئین رومیپلاستیم استفاده و نتیجه این گونه شد که بهترین غلظت IPTG برای بیان این پروتئین برابر با 1 میلی‌مولار می‌باشد که این ناحیه با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین به دست آمد. که همراستا با نتایج دیگر همکاران بود. در این مطالعه یکی از متغیرهای مستقل بیان پروتئین رومیپلاستیم در سه OD مختلف (4/0، 8/0 و 2/1) با طول‌موج 600 نانومتر بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM بر میزان بیان پروتئین رومیپلاستیم استفاده گردید و بیان شد که تغییرات غلظت میکروارگانیسم به‌طور معنی‌داری بر میزان بیان رومیپلاستیم تأثیر داشته است. (P<0.05) نمونه‌های حاوی غلظت 8/0 از میکروارگانیسم سبب بیان بیشترین میزان رومیپلاستیم شده همچنین کمترین میزان بیان رومیپلاستیم در نمونه‌های حاوی غلظت 4/0 میکروارگانیسم بوده است. همچنین ما در این مرحله از محیط کشت‌های LB, TB, M9 که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان پروتئین رومیپلاستیم استفاده نمودیم و بهترین محیط کشت برای بیان رومیپلاستیم، محیط کشت LB بود. این محیط کشت با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین به دست آمد. عبدالله زاده و همکاران در سال 2020 در مطالعه‌ای برای بهینه‌سازی تولید آنزیم پکتینار از روش آماری RSM نیز استفاده نمودند. متغیرهای مورد بررسی به این روش پکتین، زمان انکوباسیون، آمونیوم کلراید و دی پتاسیم فسفات بودند که برای تولید بهینه آنزیم مورد استفاده قرار گرفتند. بهینه‌سازی پکتین (به‌عنوان القا کننده آنزیم پکتیناز) تولید آنزیم را بیش از سایر موارد، افزایش داد. از طرف دیگر، آمونیوم کلراید (به‌عنوان منبع نیتروژن) نقش مهمی در کاهش تولید پکتیناز در حضور نیتروژن آلی داشت. در آخر آن‌ها به این نتیجه رسیدند که استفاده از روش RSM برای بهینه‌سازی تولید آنزیم مؤثر بوده و تولید آنزیم را تقریباً 12 برابر افزایش داد (از U/mg 16/1 به U/mg 16/14 رساند)(36). همچنین ابراهیمی فرد و همکاران در سال 2022، بیان ژن انتروکیناز انسانی در سه سویه از سیستم باکتریایی E.coli بنام‌های BL21، Shuffle T7 و NICO21، انواع غلظت IPTG و بیان آنزیم را در OD های مختلف از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش‌بینی متغیرهای مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده نمودند و به این نتایج دست یافتند که نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 2/1 در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 72/0 میلی‌مولار و نوع سویه باکتری ShuffleT7 بود که بیشترین بیان آنزیم مشاهده‌گردید (24). که در این مطالعه نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 8/0 در طول‌موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 1 میلی‌مولار و نوع محیط کشت LB برای بیان بیشتر پروتئین رومیپلاستیم حاصل شد. پکی‌ام و همکاران در سال 2020 در مطالعه‌ای به بهینه‌سازی تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی با استفاده از رویکردهای محاسباتی و تجربی پرداختند. آن‌ها معتقد بودند که کاربرد همه روش‌های بهینه‌سازی به ترتیب برای همه فاکتورهای حیاتی در سطح بیان و فرآیند می‌تواند منجر به بازده بالای پروتئین نوترکیب شود (37) که در این مطالعه نیز استفاده از روش RSM به‌عنوان ابزارهای محاسباتی مناسب از ویژگی‌های تاثیرگذار است که بهینه‌سازی عوامل مبتنی بر ژن و پروتئین، شناسایی سطوح بهینه تمام فاکتورهای فرآیندی انتخابی را تسهیل می‌کند. در نتیجه چنین سیستم پیشرفتهای قادر به پیش‌بینی عملکرد پروتئین در اشرشیاکلی نوترکیب بوده و آزمایشات آزمایشگاهی را بیشتر کاهش خواهد داد.
پوری در سال 2022 به اتفاق همکاران، طراحی کیفیت فرایند پروسه خالص‌سازی رومیپلاستیم را مورد بررسی قرار دادند. آن‌ها با در نظر گرفتن سه پارامتر pH، زمان انکوباسیون و نسبت سیستین/ سیستئین در مرحله ریفولد بهینه‌سازی انجام دادند. آن‌ها دست یافتند که در pH قلیایی افزایش پیوند دی سولفیدی بیشتر بوده و روی تاخوردگی مجدد پروتئین تأثیر مثبت خواهد داشت. نتایج آن‌ها اینگونه بود که با pH=8، نسبت سیستین به سیستئین 5/0 و زمان انکوباسیون 72 ساعت، بازده تاخوردگی مجدد پروتئین به 85 درصد رساندند و برای حذف ناخالصی‌ها از کروماتوگرافی HIC استفاده نمودند (38). نتایج مطالعه ما اینگونه بود که پس از تولید و جدا سازی IB از باکتری‌های نوترکیب، در اوره ۸ مولار و DTT حل شد و در حضور افزودنی‌های آرژنین، سوربیتول، تریس ریفولد شدند. نتایج بهینه Refolding در pH 6 و نسبت 1 سیستین به سیستئین و DTT 10 میلی مولار حاصل شد. خالص‌سازی را بر اساس patent Amgen با رزین Sp sepharose انجام شد. هاشم‌زایی و همکاران در سال 2023، در مطالعه‌ای با عنوان بیان پروتئین و خالص‌سازی رومیپلاستیم و تجزیه و تحلیل تولید ترشحی آن با استفاده از شبیه سازی و بررسی سیگنال پپتید آن در باکتری اشرشیاکلی، آن‌ها توالی نوکلئوتیدی رومیپلاستیم را برای بیان در سویه BL21 بهینه و برای تجزیه و تحلیل اثر سیگنال پپتید pelB از پلاسمیدهای pET-22b(+) و pET-15b استفاده نمودند (39). که پلاسمید مورد استفاده این مطالعه از نوع pET9a است. این وکتور دارای مارکر انتخابی کانامایسین و پروموتر T7 می‌باشد که از پلاسمید دیگری استفاده شد. رضوی‌پور و همکاران در سال 2022، در مطالعه‌ای با عنوان نقش مهار آنزیم فورمات دهیدروژناز در رشد باکتری صنعتی BL21، با بررسی مسیرهای متابولیکی مستند شده در وبگاه KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) با دیدگاه کاهش راندمان تولید CO2 از اسید فرمیک بررسی نمودند. نتایج آن‌ها نشان داد در محیط LB، موتان باکتری‌های اشرشیاکلی نسبت به BL21 از رشد بیشتری برخوردارند، که این تفاوت در محیط M9 بارزتر بود (40). در این مطالعه نیز در محیط کشت LB بیشترین بیان پروتئین رومیپلاستیم نسبت به M9 مشاهده‌گردید. رانا و همکاران در سال 2023 در مطالعه‌ای به بررسی ریفولدینگ پروتئین رومیپلاستیم با استفاده از گروماتوگرافی پرداختند. آن‌ها به این نتیجه دست یافتند که ریفولدینگ مجدد در شرایط بهینه، حداکثر بازده را 5/1 ± 57 درصد و خلوص بیش از 4/3 ± 73/79 درصد در رقت 25 برابری در دمای 15 درجه سانتی‌گراد می‌دهد (41). در این مطالعه نیز ما از فرآیند ریفولدینگ برای بازده بیشتر و خالص‌سازی بهتر استفاده نمودیم.
نتیجه‌گیری
در این مطالعه کلونینگ و بهینه‌سازی شرایط بیان ژن و خالص‌سازی پپتیبادی رومیپلاستیم در سویه BL21 از باکتری اشرشیا کلی صورت گرفت. بهترین OD برای بیان رومیپلاستیم 8/0، بهترین غلظت IPTG که بیشترین بیان را برای رومیپلاستیم فراهم نمود، غلظت 1 میلی‌مولار و بهترین محیط کشت مورد بررسی در این مطالعه، محیط کشت LB بود. همچنین برای شروع فرآیند خالص‌سازی ابتدا مرحله ریفولدینگ صورت گرفت، به دلیل اینکه پروتئین به نحو صحیح فولد گردد، در ادامه از ستون‌های sp-sepharose برای اتمام مراحل خالص‌سازی استفاده گردید. با استفاده از نتایج چنین تحقیقاتی، پروتئین‌های نوترکیب در مقیاس وسیع و با خلوص زیاد (تولید صنعتی)، تولید خواهد شد که می‌تواند منجر به خودکفایی در صنعت داروسازی نوترکیب شود. از کاربردهای بالینی داروی رومیپلاستیم می‌توان به کنترل پلاکت در بیماران مبتلا به اختلالات پلاکتی اشاره نمود. همچنین پیشنهاد می‌گردد برای تولید انواع پروتئین‌های نوترکیب حتماً از روش‌های بهینه‌سازی برای فاکتورهای OD، IPTG، محیط کشت و سلول میزبان استفاده گردد.
تشکر و قدردانی
از شرکت تحقیقاتی تولیدی آریا تینا ژن به خاطر فراهم نمودن امکانات و تجهیزات مناسب جهت انجام این مطالعه تقدیر و تشکر می‌گردد.
حمایت مالی
این مطالعه تحت حمایت مالی شرکت تحقیقاتی تولیدی آریا تینا ژن انجام شده است.
تعارض منافع
نویسندگان اعلام می‌کنند که هیچ‌گونه تعارض منافعی وجود ندارد.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه هیچ‌گونه ملاحظه اخلاقی ندارد.
نوع مطالعه: پژوهشي(توصیفی- تحلیلی) |
موضوع مقاله:
داروسازی
فهرست منابع
1. Kuter DJ, Bussel JB, Lyons RM, Pullarkat V, Gernsheimer TB, Senecal FM, et al. Efficacy of romiplostim in patients with chronic immune thrombocytopenic purpura: a double-blind randomised controlled trial. Lancet 2008;371(9610):395-403. http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(08)60203-2. [DOI:10.1016/S0140-6736(08)60203-2]
2. Jamali F, Lemery S, Ayalew K, Robottom S, Robie-Suh K, Rieves D, et al. Romiplostim for the treatment of chronic immune (idiopathic) thrombocytopenic purpura. Oncology (Williston Park) 2009;23(8):704-9. [Google Scholar]
3. Waknine Y. FDA Approvals: omacor, nuflexxa, combunox, and others. Medscape Today: http://www. medscape. com/viewarticle/495709. Última Visita 2004;18.
4. Mareddy C, Kalra M, Sachdeva A. Generic romiplostim for children with persistent or chronic immune thrombocytopenia: Experience from a tertiary care centre in North India. Br J Haematol 2022;197(5):618-26. http://dx.doi.org/10.1111/bjh.18126. [DOI:10.1111/bjh.18126]
5. Nicholl DST. An Introduction to Genetic Engineering. In: An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge: Cambridge University Press; 2008. p. 1-1. [DOI:10.1017/CBO9780511800986]
6. Farrukh S, Fan X, Mustafa K, Hussain A, Ayoub M, Younas M. Nanotechnology and the generation of sustainable hydrogen. Springer Nature; 2020. [DOI:10.1007/978-3-030-60402-8]
7. Bussel JB, Soff G, Balduzzi A, Cooper N, Lawrence T, Semple JW. A review of romiplostim mechanism of action and clinical applicability. Drug Des Devel Ther 2021;15:2243-68. http://dx.doi.org/10.2147/DDDT.S299591. [DOI:10.2147/DDDT.S299591]
8. Nishida T, Yamaguchi M, Tatara Y, Kashiwakura I. Proteomic changes by radio-mitigative thrombopoietin receptor agonist romiplostim in the blood of mice exposed to lethal total-body irradiation. Int J Radiat Biol 2020;96(9):1125-34. http://dx.doi.org/10.1080/09553002.2020.1787546 [DOI:10.1080/09553002.2020.1787546]
9. Piccin A, Amaddii G, Natolino F, Billio A, Cortelazzo S. Idiopathic thrombocytopenic purpura resistant to eltrombopag, but cured with romiplostim. Blood Transfus 2014;12 Suppl 1:s149-50. http://dx.doi.org/10.2450/2013.0289-12. [Google Scholar]
10. Yang AS. Development of romiplostim: a novel engineered peptibody. Semin Hematol 2015;52(1):12-5. http://dx.doi.org/10.1053/j.seminhematol.2014.10.007. [DOI:10.1053/j.seminhematol.2014.10.007]
11. Ghanima W, Cooper N, Rodeghiero F, Godeau B, Bussel JB. Thrombopoietin receptor agonists: ten years later. Haematologica 2019;104(6):1112-23. http://dx.doi.org/10.3324/haematol.2018.212845. [DOI:10.3324/haematol.2018.212845]
12. Nurden P, Kessler Cm S, Ma L, Ha S. Efficacy of romiplostim in patients with chronic immune thrombocytopenic purpura: a double-blind randomised controlled trial. Commentary 2008; (9610). [Google Scholar]
13. Al-Samkari H, Nagalla S. Efficacy and safety evaluation of avatrombopag in immune thrombocytopenia: analyses of a phase III study and long-term extension. Platelets 2022;33(2):257-64. http://dx.doi.org/10.1080/09537104.2021.1881952 [DOI:10.1080/09537104.2021.1881952]
14. Cwirla SE, Balasubramanian P, Duffin DJ, Wagstrom CR, Gates CM, Singer SC, et al. Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine. Science 1997;276(5319):1696-9. http://dx.doi.org/10.1126/science.276.5319.1696. [DOI:10.1126/science.276.5319.1696]
15. Shimamoto G, Gegg C, Boone T, Quéva C. Peptibodies: A flexible alternative format to antibodies. MAbs 2012;4(5):586-91. http://dx.doi.org/10.4161/mabs.21024. [DOI:10.4161/mabs.21024]
16. Ning L, Li Z, Bai Z, Hou S, He B, Huang J, et al. Computational design of antiangiogenic peptibody by fusing human IgG1 fc fragment and HRH peptide: Structural modeling, energetic analysis, and dynamics simulation of its binding potency to VEGF receptor. Int J Biol Sci 2018;14(8):930-7. http://dx.doi.org/10.7150/ijbs.24582. [DOI:10.7150/ijbs.24582]
17. Fayaz S, Fard-Esfahani P, Golkar M, Allahyari M, Sadeghi S. Expression, purification and biological activity assessment of romiplostim biosimilar peptibody. Daru 2016;24(1). http://dx.doi.org/10.1186/s40199-016-0156-7. [DOI:10.1186/s40199-016-0156-7]
18. Zurawa-Janicka D, Wenta T, Jarzab M, Skorko-Glonek J, Glaza P, Gieldon A, et al. Structural insights into the activation mechanisms of human HtrA serine proteases. Arch Biochem Biophys 2017;621:6-23. http://dx.doi.org/10.1016/j.abb.2017.04.004. [DOI:10.1016/j.abb.2017.04.004]
19. Tariq F, Khan MAU, Shahzad S, Chaudhary WB, Arif A, Gharib G. Production of Remedial Proteins through Genetically Modified Bacteria. Adv Life Sci 2018;5(2):37-45. [Google Scholar]
20. Zoued A, Brunet YR, Durand E, Aschtgen M-S, Logger L, Douzi B, et al. Architecture and assembly of the Type VI secretion system. Biochim Biophys Acta 2014;1843(8):1664-73. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamcr.2014.03.018. [DOI:10.1016/j.bbamcr.2014.03.018]
21. Lim J. Destabilizing single chain major histocompatibility complex class I protein for repurposed enterokinase proteolysis,2020. Sci Rep 10:1-10. [DOI:10.1038/s41598-020-71785-2]
22. Odonkor ST, Addo KK. Prevalence of multidrug-resistant Escherichia coli isolated from drinking water sources. Int J Microbiol 2018;2018:7204013. http://dx.doi.org/10.1155/2018/7204013. [DOI:10.1155/2018/7204013]
23. Melicherová K, Krahulec J, Šafránek M, Lišková V, Hopková D, Széliová D, et al. Optimization of the fermentation and downstream processes for human enterokinase production in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol 2017;101(5):1927-34. http://dx.doi.org/10.1007/s00253-016-7960-3. [DOI:10.1007/s00253-016-7960-3]
24. Ebrahimifard M, Forghanifard MM, Yamchi A, Zarrinpour V, Sharbatkhari M. A simple and efficient method for cytoplasmic production of human enterokinase light chain in E. coli. AMB Express 2022;12(1):160. http://dx.doi.org/10.1186/s13568-022-01504-9. [DOI:10.1186/s13568-022-01504-9]
25. Wingfield PT. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci 2015;80:6-7. [DOI:10.1002/0471140864.ps0601s80]
26. Leader B, Baca QJ, Golan DE. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat Rev Drug Discov 2008;7(1):21-39. http://dx.doi.org/10.1038/nrd2399. [DOI:10.1038/nrd2399]
27. Giuliano KA, Wachi S, Drew L, Dukovski D, Green O, Bastos C, et al. Use of a high-throughput phenotypic screening strategy to identify amplifiers, a novel pharmacological class of small molecules that exhibit functional synergy with potentiators and correctors. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R&D. 2018;23:111-21. [DOI:10.1177/2472555217729790]
28. Gupta SK, Shukla P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol 2016;36(6):1089-98. http://dx.doi.org/10.3109/07388551.2015.1084264 [DOI:10.3109/07388551.2015.1084264]
29. Young CL, Britton ZT, Robinson AS. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnol J 2012;7(5):620-34. http://dx.doi.org/10.1002/biot.201100155. [DOI:10.1002/biot.201100155]
30. Yusibov VM, Mamedov TG. Plants as an alternative system for expression of vaccine antigens. Proc ANAS 2010;65:195-200. [Google Scholar]
31. Legastelois I, Buffin S, Peubez I, Mignon C, Sodoyer R, Werle B. Non-conventional expression systems for the production of vaccine proteins and immunotherapeutic molecules. Hum Vaccin Immunother 2017;13(4):947-61. http://dx.doi.org/10.1080/21645515.2016.1260795 [DOI:10.1080/21645515.2016.1260795]
32. Criscuolo E, Caputo V, Diotti RA, Sautto GA, Kirchenbaum GA, Clementi N. Alternative methods of vaccine delivery: An overview of edible and intradermal vaccines. J Immunol Res 2019;2019:8303648. http://dx.doi.org/10.1155/2019/8303648. [DOI:10.1155/2019/8303648]
33. Molineux G. The development of romiplostim for patients with immune thrombocytopenia: Romiplostim for ITP. Ann N Y Acad Sci 2011;1222(1):55-63. http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.2011.05975.x. [DOI:10.1111/j.1749-6632.2011.05975.x]
34. Koolivand D, Bashir NS, Behjatnia SA, Joozani RJ. Production of Polyclonal Antibody against Grapevine fanleaf virus Movement Protein Expressed in Escherichia coli. Plant Pathol J 2016;32(5):452-9. http://dx.doi.org/10.5423/PPJ.OA.01.2016.0031. [DOI:10.5423/PPJ.OA.01.2016.0031]
35. Raikhy G, Hallan V, Kulshrestha S, Zaidi AA. Polyclonal Antibodies to the Coat Protein of Carnation etched ring virus Expressed in Bacterial System: Production and Use in Immunodiagnosis. J Phytopathol 2007;155(10):616-22. http://dx.doi.org/10.1111/j.1439-0434.2007.01287.x. [DOI:10.1111/j.1439-0434.2007.01287.x]
36. Abdollahzadeh R, Pazhang M, Najavand S, Fallahzadeh-Mamaghani V, Amani-Ghadim AR. Screening of pectinase-producing bacteria from farmlands and optimization of enzyme production from selected strain by RSM. Folia Microbiol (Praha) 2020;65(4):705-19. http://dx.doi.org/10.1007/s12223-020-00776-7. [DOI:10.1007/s12223-020-00776-7]
37. Packiam KAR, Ramanan RN, Ooi CW, Krishnaswamy L, Tey BT. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Appl Microbiol Biotechnol 2020;104(8):3253-66. http://dx.doi.org/10.1007/s00253-020-10454-w. [DOI:10.1007/s00253-020-10454-w]
38. Pouri S, Torkashvand F, Aghamirza Moghim Aliabadi H, Fard-Esfahani P, Golkar M, Vaziri B. Quality by design in downstream process development of romiplostim. Iran Biomed J 2022;26(6):414-25. http://dx.doi.org/10.52547/ibj.3790. [DOI:10.52547/ibj.3790]
39. Hashemzaei M, Negahdaripour M, Heidari R, Ghoshoon MB. Protein expression and purification of Romiplostim and analysis of its secretory production using an in silico investigated signal peptide in E. coli. Rep Biochem Mol Biol 2023;12(1):27-35. http://dx.doi.org/10.52547/rbmb.12.1.27. [PMID]
40. Razavipour R, Sepahi AA, Modarressi MH, Bambai B. Inhibitory role of formate dehydrogenase enzyme in the growth of BL21 industrial bacteria. New Cell Mol Biotech J 2022;12(46):65-74. [Google Scholar] []
41. Rana S, Ughade S, Kumthekar R, Bhambure R. Chromatography assisted in-vitro refolding and purification of recombinant peptibody: Recombinant Romiplostim a case study. Int J Biol Macromol 2023;249:126037. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.126037. [DOI:10.1016/j.ijbiomac.2023.126037]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
