دوره 34، شماره 12 - ( اسفند 1402 )
جلد 34 شماره 12 صفحات 752-742 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Research code: IR.TBZMED.REC.1395.967
Ethics code: IR.TBZMED.REC.1395.967
Clinical trials code: ------------------
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Valizadeh R, Abasi E, Jalili R, Mohajeri N, Alizadeh E. EVALUATION OF PLATINUM NANOPARTICLES EFFECTS ON CELL CYCLE AND EXPRESSION OF SOX2 AND OCT-4 GENES IN MESENCHYMAL STEM CELLS. Studies in Medical Sciences 2024; 34 (12) :742-752
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-6181-fa.html
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-6181-fa.html
ولیزاده رویا، عباسی الهام، جلیلی رقیه، مهاجری نسرین، علیزاده عفت. ارزیابی تأثیر نانو ذرات پلاتینوم بر چرخه سلولی و بیان ژن‌های Sox-2 Oct-4 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی. مجله مطالعات علوم پزشکی. 1402; 34 (12) :742-752
ارزیابی تأثیر نانو ذرات پلاتینوم بر چرخه سلولی و بیان ژن‌های Sox-2 Oct-4 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی
دانشیار زیست فناوری پزشکی، گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده علوم نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران (نویسنده مسئول) ، e.alizadeh.2010@gmail.com
متن کامل [PDF 606 kb]
(333 دریافت)
| چکیده (HTML) (694 مشاهده)
جدول (1): لیست پرایمرهای گونه موش مورد استفاده در Real time PCR
.jpg)
.jpg)
تأثیر بر پیشرفت چرخه سلولی:
تجزیه و تحلیل چرخه سلول‌های بنیادی تیمار شده با نانو ذرات پلاتین نشان داد که در این سلول‌ها به شدت چرخه سلولی دچار تغییر می‌گردد به نحوی که با افزایش درصد سلول‌های اپاپتوتیک در فاز subG از 25/0 درصد به 1/2 درصد، تجمع سلول‌ها در فاز S از 88/17 درصد در سلول‌های کنترل به 75/46 و 43/23 درصد و کاهش شدید جمعیت سلول‌ها در G0/G1 از 2/60درصد در کنترل به 34درصد و 57درصد در گروه‌های تیمار شده موجب مشکلاتی در چرخه سلولی می‌گردد. که این اثرات هم در غلظت 300 و هم در 800 میکروگرم در میلی لیتر از نانو ذرات پلاتین مشهود است با افزایش دوز شدیدتر می‌باشد. (شکل 3). در واقع، نانو ذرات پلاتین رشد و تکثیر سلولی را در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده کند و مشکل می‌کند.
.jpg)
.jpg)
بحث و نتیجه‌گیری
استفاده از آلیاژها و فلزات در دنیای پزشکی بسیار متداول شده است در این میان فلز پلاتین به دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی خاصی که دارد و سبب پایداری آن می‌شود. فلز بسیار پرکاربرد و مفیدی محسوب می‌شود (34). از این ماده و مشتقات آن در درمان سرطان استفاده می‌گردد (35). همچنین در ساخت اقلامی مانند روکش‌های دندان، ابزارها و پین‌های جراحی استفاده می‌گردد. همچنین جهت درمان دیسک کمر، دیسک گردن، ستون فقرات، انواع شکستگی استخوان پا و مچ دست، معمولاً از پلاتین استفاده می‌شود (36). در دهه اخیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی اتولوگ بعنوان منبع بسیار مهمی در مطالعات توکسیسیته متریالها استفاده شده‌اند. به‌ویژه سلول‌های بنیادی مدل حیوانی که از مغز استخوان یا بافت چربی در دسترس و قابل استخراج می‌باشند (37)، سلول‌های بنیادی استخراج شده از مغز استخوان نسبت به انواع دیگر سلول‌ها از مزایای ویژه‌ای برخوردارند و موجب بقای سلول‌های عصبی شده و از آپوپتوز آن‌ها جلوگیری می‌کنند و به این ترتیب باعث بهبود عملکرد آن‌ها می‌شود (38). در مطالعه حاضر، ما اثر نانو ذرات پلاتین را بر روی بنیادینگی (stemness) سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش بررسی کردیم. نانو ذرات پلاتین با اندازه متوسط تقریباً 180 نانومتر و پتانسیل زتا +25.8 شناسایی شدند. پتانسیل زتا که بعنوان یک پارامتراصلی برای مشخص نمودن پایداری سوسپانسیونی نانو ذرات اندازه گیری می‌شود. به‌طور کلی وقتی پایداری نانو ذرات گزارش می‌گردد مقدار پتانسیل زتا بیشتر از 30 میلی ولت پایداری خوب و کمتر از 2 میلی ولت موجب اگرگاسیون و ناپایداری آن‌ها می‌شود (39). پتانسیل زتا برای نانو ذرات این مطالعه +25.8 بود که نشان‌دهنده‌ی پایداری مطلوب نانو ذرات پلاتین است.
پس از ارزیابی سمیت نانو ذرات پلاتین با آزمون MTT، سمیت وابسته به غلظت و زمان این نانو ذرات بر روی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تعیین شد. این نتایج مطابق با یافته‌های یک مطالعه قبلی بود که هر چند در آن سلول‌های بنیادی مطالعه نشدند اما نانو ذرات پلاتینیوم تأثیر منفی بر زنده‌مانی سلول‌های لوکمیا نشان داد (40). تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با نانو ذرات پلاتین افزایش درصد سلول‌ها در فاز S و کاهش سلول‌ها در G0/G1 را نشان داد که نقش منفی این نانو ذرات در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده را نشان می‌دهد. در یک مقاله مشابه که روی سلول‌های سرطانی MCF-7 انجام شد افزایش سلول‌ها در G0/G1 گزارش گردید (45) که احتمالاً به دلیل متغیر بودن شرایط آزمایشات متفاوت از نتیجه این مطالعه است.
از آنجاییکه بسیاری از عملکردهای سلول‌ها با فعالیت ژن‌های آن‌ها انجام و مرتبط است در این مطالعه ارزیابی بیان ژن‌های بنیادی با روش Real-time PCR انجام شد که نشان داد که در سلول‌های تیمار شده، ژن‌های Sox-2 و Oct4 به‌طور معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل سرکوب شدند. در مطالعه دیگری که توسط گروه ما انجام و در سال 2022 چاپ شد نانو ذرات تیتانیوم بر سلول‌های بنیادی انجام شد اثر منفی روی زنده‌مانی سلول‌های بنیادی نشان داد و حتی منجر به پیری گردید (41) که نتایج این مطالعه را تأیید می‌نماید. همچنین مطالعه اثر نانو ذرات اکسید روی بر سلول‌های بنیادی نشان داد که سایز کوچکتر این نانو ذرات تأثیر منفی بیشتر بر زنده‌مانی و خواص بنیادینگی این سلول‌ها دارد که این یافته‌ها در راستای یافته‌های این مطالعه می‌باشد (42). همچنین مطالعه عابد و همکاران نشان داد که استفاده از نانو ذرات پلاتینیوم می‌تواند شدت اثرات ضدسرطانی فوتوترمال را به‌صورت هم افزایی در سلول‌های MCF-7 افزایش دهد (43). در این مطالعه از روش سنتز سبز برای تهیه نانو ذرات پلاتینیوم استفاده شد. در مطالعه دیگری که در سلول‌های MCF-7 انجام شد که باز با روش سبز انجام شد اندازه نانوذره مشابه کار ما بود و پتانسیل زتا هم اندازه گیری شد که معادل -23 بود (44).
در نهایت، یافته‌های ما نشان می‌دهد که نانو ذرات پلاتین می‌توانند تکثیر، چرخه سلولی و خواص بنیادینگی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را کاهش دهند. این یافته‌ها نشان می‌دهد که استفاده در دوزهای بالا و مدت‌زمانهای طولانی ممکن است بتواند باعث ایجاد عوارض احتمالی در سلول‌های بنیادی بیماران باشد.
در این مطالعه امکان بررسی بیشتر اثرات نانو ذرات پلاتنیوم در شرایط درون تن در حیوانات آزمایشگاهی و در انسان میسر نشد که می‌تواند در مطالعات آینده مورد بررسی قرار گیرد. همچنین پیشنهاد می‌شود نظر به اهمیت چک کردن امکان ایجاد کم خونی‌ها، در کارهای آینده مطالعه اثرات این نانو ذرات به‌ویژه اثر دراز مدت آن‌ها بر همولیز و سلول‌های خونی مورد بررسی قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم می‌دانند مراتب تشکر و قدردانی خود را از گروه بیوتکنولوژی پزشکی و دانشکده علوم نوین پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تبریزو همچنین گروه شیمی دانشگاه تبریز به خاطر حمایت‌های معنوی این اثر اظهار دارند.
حمایت مالی تحقیق
این تحقیق توسط معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی تبریز حمایت مالی شده است.
تضاد منافع
نویسندگان هیچ تضاد منافعی اظهار ننمودند.
ملاحضات اخلاقی
این مطالعه دارای مجوز اخلاق با شماره IR.TBZMED.REC.1395.967 از دانشگاه علوم پزشکی تبریز است.
متن کامل: (64 مشاهده)
مقدمه
پتانسیل درمانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی[1] (MSCs) در بازسازی بافت های آسیب‌دیده، منجر به ایجاد پاسخ ترمیمی در مجموعه‌ای گسترده از آسیب‌ها شده است (1،2). سلول‌های بنیادی مزانشیمی عوامل درمانی جذابی هستند که در مغز استخوان، بافت چربی و بند ناف یافت می‌شوند که توانایی زیادی در رگ زایی و استخوان‌سازی در ترمیم نقایص استخوانی با شیوع کم بیماری پیوند در مقابل میزبان دارند (1،3). سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) توانایی زیادی برای انتقال سلول‌های تمایزیافته از طریق درمان با نانو ذرات دارند که عمدتاً تحت تأثیر اندازه، شکل، نسبت ابعاد، غلظت، بار سطحی و مساحت سطح نانو ذرات است (4-6) معرفی نانو ذرات در زمینه پزشکی بازساختی، مواد بیوشیمیایی پیشرفته‌ای را برای مهندسی بافت کنترل‌شده فراهم کرده است (7). طیف گسترده‌ای از نانومواد در رویکردهای مبتنی بر سلول‌های بنیادی استفاده می‌شوند که نقش برجسته‌ای در بازسازی آسیب‌ها، شکستگی استخوان، پیری و بهبود زخم دارند. علاوه بر این، پایداری ساختاری و خواص برتر نانو ذرات آلیاژی کاربرد آن‌ها را در پزشکی احیاکننده و دارورسانی افزایش داده است (6،8-10). همچنین نانو ذرات پلاتین در درمان سرطان استفاده می‌شوند به‌ویژه داروهایی از قبیل سیس پلاتین، کرایوپلاتین و اگزالی پلاتین که پرکاربرد هستند (11). بعلاوه، نانو ذرات پلاتین (PtNPs) ازجمله نانو ذرات فلزی است که دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی مانند فعالیت کاتالیزوری بالا و کارایی بالا هست (12). مطالعات متعددی فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانو ذرات پلاتین را نشان دادند (13-16). در این راستا، گزارش شده است که نانو ذرات پلاتین می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی التهاب ناشی از لیپوپلی ساکارید را در ماکروفاژهای RAW 264.7 کاهش دهند که به خواص آنتی‌اکسیدانی نانو ذرات پلاتین نسبت داده شده است (17). علاوه بر این، ویژگی‌های درمانی نانو ذرات پلاتین به دلیل توانایی آن‌ها در کاهش استئوکلاستوژنز همراه با افزایش اتصال و تکثیر سلول‌ها برای کاربردهای ارتوپدی قابل‌توجه است (18).
بسیاری از مطالعات صورت گرفته نشان داده‌اند که این نانومواد به‌درستی زیست سازگاری امیدوارکننده‌ای را نشان می‌دهند (20،19). اگرچه توسعه نانو ذرات آلیاژی در 20 سال گذشته تکامل یافته است، بااین‌حال مطالعات دقیق‌تری در مورد کاربردهای زیست پزشکی این نانو ذرات موردنیاز است. این نانو ذرات به شکل آزاد نیاز به مطالعه بیشتر دارند تا سایر عملکردهای آن‌ها نسبت به سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) مانند تأثیر بر بنیادینگی (stemness) سلول‌های بنیادی و سمیت سلولی سلول‌های بنیادی مشخص شود. درواقع، محیط میکرو سلول‌های بنیادی نقش مهمی در فنوتیپ و عملکرد سلولی ایفا می‌کند (21،19). در یک مطالعه اخیر مشخص شد که نانو ذرات پلاتینیوم باعث ایجاد سمیت سلولی، آپاپتوز و پاسخ‌های التهابی در سلول‌های لوکمیای انسانی شد (22). بنابراین در این مطالعه بر آن شدیم که اثر این مواد بر پایه پلاتینیوم را بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی به‌عنوان گروه مهمی از سلول‌های مورداستفاده در پزشکی بررسی نماییم. هدف این مطالعه بررسی تأثیرات بیولوژیکی نانو ذرات پلاتین، استفاده‌شده در پزشکی بر شاخص‌های ژنی و سلولی بنیادینگی (stemness) و چرخه سلولی MSCs بود.
مواد و روش کار
نوع مطالعه:
در این مطالعه علوم پایه و توصیفی که روی سلول‌های بنیادی انجام شد، تأثیر نانو ذرات پلاتینیوم بر مارکرهای ژنی بنیادینگی ازجمله ژن‌های Sox-2 و Oct-4، همچنین چرخه سلولی آن‌ها و تشکیل کلنی مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد شیمیایی و معرف‌ها:
نانو ذرات فلز پلاتین از شرکت نانوزیست فناوران، تترازولیوم MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylterazolium bromide از سیگما آلدریچ خریداری شد. محیط کشت DMEM سرم جنین گاوی (FBS) و Trypsin/EDTA 0.25 درصد از Gibco USA به دست آمد. مواد استخراج RNA از شرکت یکتا تجهیز خریداری شد و همچنین کیت سنتز cDNA و Prime Script RT Master Mix از تاکارا (توکیو، ژاپن) تهیه شد. پرایمرهای اختصاصی پس از طراحی از پیشگام بیوتک خریداری شد. حلال‌های آلی از شرکت مرک یا سیگما همچنین propidium iodide (PI) از شرکت سیگما با واسطه شرکت‌های داخلی خریداری شد.
سنتز و شناسایی نانو ذرات پلاتین:
نانو ذرات پلاتین با احیای یون پلاتین با اتانول در حضور پلی وینیل پیرولیدون (PVP) سنتز شدند. ابتدا یک محلول حاوی 15 میلی‌لیتر K2PtCl4 2 در آب دیونیزه تهیه شد. سپس 0.0667 گرم پلی وینیل پیرولیدون (PVP) و 10 میکرولیتر هیدروکلریک اسید (1 مولار) به محلول مذکور اضافه شد و مخلوط به مدت 5 دقیقه به‌هم زده شد. پس از افزایش 14 میلی لیتر اتانول، رنگ محلول قهوه‌ای تیره شد. تمام آزمایش‌ها در دمای اتاق انجام شد (23، 24). نانو ذرات پلاتین به‌دست‌آمده برای بررسی‌های بیشتر در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
مورفولوژی و اندازه ذرات نانو ذرات پلاتین سنتز شده به ترتیب با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM، FEI TEC9G20) و پراکندگی نور دینامیکی (DLS) (Malvern Zetasizer Nano ZS90، UK) مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، میانگین قطر هیدرودینامیکی زتا برای نشان دادن تک پراکندگی نانو ذرات پلاتین که با آب فوق خالص رقیق شده بودند اندازه‌گیری شد اندازه گیری پتانسیل زتا در دمای 25 درجه سانتی‌گراد انجام شد (23، 24).
کشت سلولی:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت استخوان موش از بن یاخته‌های رویان خریداری شد. این سلول‌ها در محیط DMEM حاوی 10درصد FBS (v/v)، 100 واحد بر میلی لیتر پنی سیلین و 50 میلی گرم در میلی لیتر استرپتومایسین کشت داده شدند (26،25).
بررسی زنده‌مانی سلول‌ها:
سنجش رنگ سنجی MTT برای ارزیابی سمیت و تأثیر نانو ذرات پلاتین بر زنده‌مانی سلول‌ها انجام شد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پلیت های 96 چاهکی با تراکم سلولی 5000 سلول در هر چاهک در پلیت 96 خانه با استفاده از محیط کشت DMEM حاوی 10درصد سرم جنین گاو و یک درصد انتی بیوتیک تلقیح شدند. پس از 24 ساعت، وضعیت سلول‌ها زیر میکروسکوپ اینورت چک گردید و با در نظر گرفتن اینکه سلول‌ها به کف فلاسک چسبیده و تعداد سلول‌ها به حد کافی رسید غلظت‌های مختلف نانو ذرات پلاتین تهیه شد. در مرحله بعدی مایع رویی خارج و غلظت‌های مختلف به‌صورت سه تکرار به چاهک‌ها اضافه شد. پس از 144 ساعت محیط کشت رویی خارج شد و سپس غلظت 2 میلی گرم در میلی لیتر از پودر MTT در محیط کشت تهیه گردید و بعد مایع رویی سلول‌های آسپیره شد و محلول MTT به هر چاهک اضافه گردید. پس از 4 ساعت انکوباسیون (37 درجه سانتی‌گراد، 5درصد CO2)) مایع رویی خارج گردید و 100 میکرولیتر DMSO به‌عنوان حلال کریستالهای فورمازان جایگزین شد. پس از تکان دادن ملایم در دمای اتاق و تاریکی به مدت 15 دقیقه، جذب نوری فورمازان در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه میکروپلیت‌خوان (ELISA Reader) (سری 7250-7000CE، انگلستان) اندازه‌گیری و ثبت شد (27).
مطالعه چرخه سلولی:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی با دوز نانو ذرات پلاتین 300 میلی گرم در میلی لیتر به مدت 144 ساعت تیمار شدند. پس از تریپسینه کردن سلول‌ها، اثر تریپسین با محیط کشت حاوی FBS خنثی شد و سپس شستشو با 2 سی سی Phosphate buffer saline (PBS)، سلول‌ها در اتانول سرد 70 درصد تثبیت شدند در این مطالعه PBS از ترکیب 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 EDTA ساخته شد و pH روی 7.2 تنظیم گردیده است. سپس به مدت 48 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از سانتریفیوژ در 1500 rpm به مدت 5 دقیقه، سلول‌های جمع‌آوری‌شده با 2 سی سی PBS شسته شدند و در 10 میکرولیتر محلول رنگ‌آمیزی یدید پروپیدیوم (40 میکروگرم بر میلی‌لیتر، RNase A 100 میکروگرم در میلی‌لیتر، و PBS) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و تاریکی به مدت 30 دقیقه مجدداً معلق شدند. چرخه سلولی توسط فلوسایتومتر با استفاده از BD FACSCalibur تجزیه و تحلیل شد و درصد سلول‌ها در فازهای G0/G1، S و G2/M توسط نرم‌افزار Cell Quest برآورد شد (29،28).
سنجش تشکیل کلونی سلولی در شرایط آزمایشگاهی:
برای تعیین بقای سلولی در برابر نانو ذرات پلاتین روش تشکیل کلونی استفاده شد. برای این منظور، سلول‌های بنیادی مزانشیمی در سه تکرار و با 200 سلول در هر چاهک در یک پتری دیش 100 میلی متری در محیط استاندارد در پاساژ سوم (P3) کشت داده شدند. سپس محیط با محیط تازه حاوی mg. ml-1 1.25 از هر نانوذره تغییر یافت. پس از 14 روز، کلنی‌های سلولی با گلوتارآلدئید 2.5 درصد به مدت 15 دقیقه تثبیت شدند. سپس سلول‌ها با کریستال ویولت 0.5درصد به مدت 30 دقیقه رنگ آمیزی شدند و سپس با PBS شستشو شدند. کلنی‌ها در زیر میکروسکوپ نوری شمارش شدند.
تجزیه و تحلیل کمی Real-time PCR (qPCR):
استخراج RNA تام توسط کیت استخراج RNA از کمپانی BioBasic بر اساس پروتوکل سازنده انجام شد. سپس کمیت RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ بررسی شد. در مرحله بعد 1 میکروگرم از RNA تام برای سنتز cDNA از نمونه‌ها توسط کیت سنتز cDNA از کمپانی فرمنتاز بر اساس پروتکل سازنده استفاده شد.
RT-qPCR بر روی Light Cycler 96 (روش، آلمان) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی (جدول 1) و SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Amplicon) انجام شد. شرایط چرخه‌های دمایی به شرح زیر بود:
95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه و سپس 30 چرخه (95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 ثانیه، 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه)
توالی پرایمرها در جدول 1 نشان داده شده است. ژن GAPDH به‌عنوان ژن house keeping استفاده شد. نتایج با روش 2– ΔΔCt تجزیه و تحلیل شدند (30).
پتانسیل درمانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی[1] (MSCs) در بازسازی بافت های آسیب‌دیده، منجر به ایجاد پاسخ ترمیمی در مجموعه‌ای گسترده از آسیب‌ها شده است (1،2). سلول‌های بنیادی مزانشیمی عوامل درمانی جذابی هستند که در مغز استخوان، بافت چربی و بند ناف یافت می‌شوند که توانایی زیادی در رگ زایی و استخوان‌سازی در ترمیم نقایص استخوانی با شیوع کم بیماری پیوند در مقابل میزبان دارند (1،3). سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) توانایی زیادی برای انتقال سلول‌های تمایزیافته از طریق درمان با نانو ذرات دارند که عمدتاً تحت تأثیر اندازه، شکل، نسبت ابعاد، غلظت، بار سطحی و مساحت سطح نانو ذرات است (4-6) معرفی نانو ذرات در زمینه پزشکی بازساختی، مواد بیوشیمیایی پیشرفته‌ای را برای مهندسی بافت کنترل‌شده فراهم کرده است (7). طیف گسترده‌ای از نانومواد در رویکردهای مبتنی بر سلول‌های بنیادی استفاده می‌شوند که نقش برجسته‌ای در بازسازی آسیب‌ها، شکستگی استخوان، پیری و بهبود زخم دارند. علاوه بر این، پایداری ساختاری و خواص برتر نانو ذرات آلیاژی کاربرد آن‌ها را در پزشکی احیاکننده و دارورسانی افزایش داده است (6،8-10). همچنین نانو ذرات پلاتین در درمان سرطان استفاده می‌شوند به‌ویژه داروهایی از قبیل سیس پلاتین، کرایوپلاتین و اگزالی پلاتین که پرکاربرد هستند (11). بعلاوه، نانو ذرات پلاتین (PtNPs) ازجمله نانو ذرات فلزی است که دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی مانند فعالیت کاتالیزوری بالا و کارایی بالا هست (12). مطالعات متعددی فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانو ذرات پلاتین را نشان دادند (13-16). در این راستا، گزارش شده است که نانو ذرات پلاتین می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی التهاب ناشی از لیپوپلی ساکارید را در ماکروفاژهای RAW 264.7 کاهش دهند که به خواص آنتی‌اکسیدانی نانو ذرات پلاتین نسبت داده شده است (17). علاوه بر این، ویژگی‌های درمانی نانو ذرات پلاتین به دلیل توانایی آن‌ها در کاهش استئوکلاستوژنز همراه با افزایش اتصال و تکثیر سلول‌ها برای کاربردهای ارتوپدی قابل‌توجه است (18).
بسیاری از مطالعات صورت گرفته نشان داده‌اند که این نانومواد به‌درستی زیست سازگاری امیدوارکننده‌ای را نشان می‌دهند (20،19). اگرچه توسعه نانو ذرات آلیاژی در 20 سال گذشته تکامل یافته است، بااین‌حال مطالعات دقیق‌تری در مورد کاربردهای زیست پزشکی این نانو ذرات موردنیاز است. این نانو ذرات به شکل آزاد نیاز به مطالعه بیشتر دارند تا سایر عملکردهای آن‌ها نسبت به سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) مانند تأثیر بر بنیادینگی (stemness) سلول‌های بنیادی و سمیت سلولی سلول‌های بنیادی مشخص شود. درواقع، محیط میکرو سلول‌های بنیادی نقش مهمی در فنوتیپ و عملکرد سلولی ایفا می‌کند (21،19). در یک مطالعه اخیر مشخص شد که نانو ذرات پلاتینیوم باعث ایجاد سمیت سلولی، آپاپتوز و پاسخ‌های التهابی در سلول‌های لوکمیای انسانی شد (22). بنابراین در این مطالعه بر آن شدیم که اثر این مواد بر پایه پلاتینیوم را بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی به‌عنوان گروه مهمی از سلول‌های مورداستفاده در پزشکی بررسی نماییم. هدف این مطالعه بررسی تأثیرات بیولوژیکی نانو ذرات پلاتین، استفاده‌شده در پزشکی بر شاخص‌های ژنی و سلولی بنیادینگی (stemness) و چرخه سلولی MSCs بود.
مواد و روش کار
نوع مطالعه:
در این مطالعه علوم پایه و توصیفی که روی سلول‌های بنیادی انجام شد، تأثیر نانو ذرات پلاتینیوم بر مارکرهای ژنی بنیادینگی ازجمله ژن‌های Sox-2 و Oct-4، همچنین چرخه سلولی آن‌ها و تشکیل کلنی مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد شیمیایی و معرف‌ها:
نانو ذرات فلز پلاتین از شرکت نانوزیست فناوران، تترازولیوم MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylterazolium bromide از سیگما آلدریچ خریداری شد. محیط کشت DMEM سرم جنین گاوی (FBS) و Trypsin/EDTA 0.25 درصد از Gibco USA به دست آمد. مواد استخراج RNA از شرکت یکتا تجهیز خریداری شد و همچنین کیت سنتز cDNA و Prime Script RT Master Mix از تاکارا (توکیو، ژاپن) تهیه شد. پرایمرهای اختصاصی پس از طراحی از پیشگام بیوتک خریداری شد. حلال‌های آلی از شرکت مرک یا سیگما همچنین propidium iodide (PI) از شرکت سیگما با واسطه شرکت‌های داخلی خریداری شد.
سنتز و شناسایی نانو ذرات پلاتین:
نانو ذرات پلاتین با احیای یون پلاتین با اتانول در حضور پلی وینیل پیرولیدون (PVP) سنتز شدند. ابتدا یک محلول حاوی 15 میلی‌لیتر K2PtCl4 2 در آب دیونیزه تهیه شد. سپس 0.0667 گرم پلی وینیل پیرولیدون (PVP) و 10 میکرولیتر هیدروکلریک اسید (1 مولار) به محلول مذکور اضافه شد و مخلوط به مدت 5 دقیقه به‌هم زده شد. پس از افزایش 14 میلی لیتر اتانول، رنگ محلول قهوه‌ای تیره شد. تمام آزمایش‌ها در دمای اتاق انجام شد (23، 24). نانو ذرات پلاتین به‌دست‌آمده برای بررسی‌های بیشتر در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
مورفولوژی و اندازه ذرات نانو ذرات پلاتین سنتز شده به ترتیب با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM، FEI TEC9G20) و پراکندگی نور دینامیکی (DLS) (Malvern Zetasizer Nano ZS90، UK) مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، میانگین قطر هیدرودینامیکی زتا برای نشان دادن تک پراکندگی نانو ذرات پلاتین که با آب فوق خالص رقیق شده بودند اندازه‌گیری شد اندازه گیری پتانسیل زتا در دمای 25 درجه سانتی‌گراد انجام شد (23، 24).
کشت سلولی:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت استخوان موش از بن یاخته‌های رویان خریداری شد. این سلول‌ها در محیط DMEM حاوی 10درصد FBS (v/v)، 100 واحد بر میلی لیتر پنی سیلین و 50 میلی گرم در میلی لیتر استرپتومایسین کشت داده شدند (26،25).
بررسی زنده‌مانی سلول‌ها:
سنجش رنگ سنجی MTT برای ارزیابی سمیت و تأثیر نانو ذرات پلاتین بر زنده‌مانی سلول‌ها انجام شد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پلیت های 96 چاهکی با تراکم سلولی 5000 سلول در هر چاهک در پلیت 96 خانه با استفاده از محیط کشت DMEM حاوی 10درصد سرم جنین گاو و یک درصد انتی بیوتیک تلقیح شدند. پس از 24 ساعت، وضعیت سلول‌ها زیر میکروسکوپ اینورت چک گردید و با در نظر گرفتن اینکه سلول‌ها به کف فلاسک چسبیده و تعداد سلول‌ها به حد کافی رسید غلظت‌های مختلف نانو ذرات پلاتین تهیه شد. در مرحله بعدی مایع رویی خارج و غلظت‌های مختلف به‌صورت سه تکرار به چاهک‌ها اضافه شد. پس از 144 ساعت محیط کشت رویی خارج شد و سپس غلظت 2 میلی گرم در میلی لیتر از پودر MTT در محیط کشت تهیه گردید و بعد مایع رویی سلول‌های آسپیره شد و محلول MTT به هر چاهک اضافه گردید. پس از 4 ساعت انکوباسیون (37 درجه سانتی‌گراد، 5درصد CO2)) مایع رویی خارج گردید و 100 میکرولیتر DMSO به‌عنوان حلال کریستالهای فورمازان جایگزین شد. پس از تکان دادن ملایم در دمای اتاق و تاریکی به مدت 15 دقیقه، جذب نوری فورمازان در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه میکروپلیت‌خوان (ELISA Reader) (سری 7250-7000CE، انگلستان) اندازه‌گیری و ثبت شد (27).
مطالعه چرخه سلولی:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی با دوز نانو ذرات پلاتین 300 میلی گرم در میلی لیتر به مدت 144 ساعت تیمار شدند. پس از تریپسینه کردن سلول‌ها، اثر تریپسین با محیط کشت حاوی FBS خنثی شد و سپس شستشو با 2 سی سی Phosphate buffer saline (PBS)، سلول‌ها در اتانول سرد 70 درصد تثبیت شدند در این مطالعه PBS از ترکیب 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 EDTA ساخته شد و pH روی 7.2 تنظیم گردیده است. سپس به مدت 48 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از سانتریفیوژ در 1500 rpm به مدت 5 دقیقه، سلول‌های جمع‌آوری‌شده با 2 سی سی PBS شسته شدند و در 10 میکرولیتر محلول رنگ‌آمیزی یدید پروپیدیوم (40 میکروگرم بر میلی‌لیتر، RNase A 100 میکروگرم در میلی‌لیتر، و PBS) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و تاریکی به مدت 30 دقیقه مجدداً معلق شدند. چرخه سلولی توسط فلوسایتومتر با استفاده از BD FACSCalibur تجزیه و تحلیل شد و درصد سلول‌ها در فازهای G0/G1، S و G2/M توسط نرم‌افزار Cell Quest برآورد شد (29،28).
سنجش تشکیل کلونی سلولی در شرایط آزمایشگاهی:
برای تعیین بقای سلولی در برابر نانو ذرات پلاتین روش تشکیل کلونی استفاده شد. برای این منظور، سلول‌های بنیادی مزانشیمی در سه تکرار و با 200 سلول در هر چاهک در یک پتری دیش 100 میلی متری در محیط استاندارد در پاساژ سوم (P3) کشت داده شدند. سپس محیط با محیط تازه حاوی mg. ml-1 1.25 از هر نانوذره تغییر یافت. پس از 14 روز، کلنی‌های سلولی با گلوتارآلدئید 2.5 درصد به مدت 15 دقیقه تثبیت شدند. سپس سلول‌ها با کریستال ویولت 0.5درصد به مدت 30 دقیقه رنگ آمیزی شدند و سپس با PBS شستشو شدند. کلنی‌ها در زیر میکروسکوپ نوری شمارش شدند.
تجزیه و تحلیل کمی Real-time PCR (qPCR):
استخراج RNA تام توسط کیت استخراج RNA از کمپانی BioBasic بر اساس پروتوکل سازنده انجام شد. سپس کمیت RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ بررسی شد. در مرحله بعد 1 میکروگرم از RNA تام برای سنتز cDNA از نمونه‌ها توسط کیت سنتز cDNA از کمپانی فرمنتاز بر اساس پروتکل سازنده استفاده شد.
RT-qPCR بر روی Light Cycler 96 (روش، آلمان) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی (جدول 1) و SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Amplicon) انجام شد. شرایط چرخه‌های دمایی به شرح زیر بود:
95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه و سپس 30 چرخه (95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 ثانیه، 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه)
توالی پرایمرها در جدول 1 نشان داده شده است. ژن GAPDH به‌عنوان ژن house keeping استفاده شد. نتایج با روش 2– ΔΔCt تجزیه و تحلیل شدند (30).
جدول (1): لیست پرایمرهای گونه موش مورد استفاده در Real time PCR
| Primer Reverse | Primer Forward | Gene |
| CTTAAGCCTCGGGCTCCAAA | CAGGAGTTGTCAAGGCAGAGA | Sox2 |
| GTCTACCTCCCTTGCCTTGG | CCTTTCCCTCTGTTCCCGTC | Oct4 |
| AGATCCACGACGGACACATT | AGAAGACTGTGGATGGCCC | GAPDH |
تجزیه و تحلیل آماری و محاسبات:
نتایج بر اساس حداقل نمونه‌های سه تکراری SD ± گزارش شده است. برای تجزیه و تحلیل از نرم‌افزار Graph Pad Prism (نسخه 10) استفاده شد. نرمال سازی داده‌ها با استفاده از آزمون t-paired و ANOVA یک طرفه ارزیابی شد و مقدار p value <0.05 ازنظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
خصوصیات نانو ذرات پلاتین:
اندازه و پتانسیل زتا عوامل اصلی در سنتز نانو ذرات و کاربرد آن برای تحقیقات سلولی هستند (31). ساختار و اندازه نانو ذرات پلاتین از طریق آنالیز TEM مورد بررسی قرار گرفت. مطابق شکل 1، نانو ذرات پلاتین دارای ساختار کروی بوده و به درستی و بدون تجمع از یکدیگر جدا شده‌اند. تجزیه و تحلیل پتانسیل زتا نشان داد که بار سطحی نانو ذرات پلاتین +25.8 میلی ولت است (شکل 1). و اندازه‌ی آن‌ها 180 نانومتر نتیجه پایداری مورفولوژیکی نانو ذرات سنتز شده را تأیید کرد.
نتایج بر اساس حداقل نمونه‌های سه تکراری SD ± گزارش شده است. برای تجزیه و تحلیل از نرم‌افزار Graph Pad Prism (نسخه 10) استفاده شد. نرمال سازی داده‌ها با استفاده از آزمون t-paired و ANOVA یک طرفه ارزیابی شد و مقدار p value <0.05 ازنظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
خصوصیات نانو ذرات پلاتین:
اندازه و پتانسیل زتا عوامل اصلی در سنتز نانو ذرات و کاربرد آن برای تحقیقات سلولی هستند (31). ساختار و اندازه نانو ذرات پلاتین از طریق آنالیز TEM مورد بررسی قرار گرفت. مطابق شکل 1، نانو ذرات پلاتین دارای ساختار کروی بوده و به درستی و بدون تجمع از یکدیگر جدا شده‌اند. تجزیه و تحلیل پتانسیل زتا نشان داد که بار سطحی نانو ذرات پلاتین +25.8 میلی ولت است (شکل 1). و اندازه‌ی آن‌ها 180 نانومتر نتیجه پایداری مورفولوژیکی نانو ذرات سنتز شده را تأیید کرد.
شکل (1): خصوصیات نانو ذرات پلاتینوم (A) پتانسیل زتا نانو ذرات پلاتین در دمای 25 درجه سانتی‌گراد. (B) تصویر TEM نانو ذرات پلاتین
کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی:
سلول‌های بنیادی مزانشیمی به شکل تک لایه چسبنده کشت داده شدند و در P2 و P3 برداشت شدند. تصاویر میکروسکوپ نوری مورفولوژی دوکی مانند، کشیده و مسطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی را نشان داد.
ارزیابی زنده ماندن سلول:
سمیت سلولی و فعالیت متابولیکی سلول‌های بنیادی مزانشیمی
در حضور نانو ذرات پلاتین، از طریق روش MTT مبتنی بر تترازولیوم ارزیابی شد. با توجه به شکل 2، اثرات نانو ذرات استفاده شده بر رشد و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی به روشی وابسته به دوز و زمان بود. زمانی که سلول‌ها به مدت 144 ساعت در معرض 1000 میکروگرم در میلی لیتر پلاتین قرار گرفتند، زنده ماندن سلول‌های بنیادی مزانشیمی 50 درصد کاهش یافت. سمیت سلولی نانومواد به گروه‌های عاملی سطحی آن‌ها نسبت داده می‌شود (شکل 2).
سلول‌های بنیادی مزانشیمی به شکل تک لایه چسبنده کشت داده شدند و در P2 و P3 برداشت شدند. تصاویر میکروسکوپ نوری مورفولوژی دوکی مانند، کشیده و مسطح سلول‌های بنیادی مزانشیمی را نشان داد.
ارزیابی زنده ماندن سلول:
سمیت سلولی و فعالیت متابولیکی سلول‌های بنیادی مزانشیمی
در حضور نانو ذرات پلاتین، از طریق روش MTT مبتنی بر تترازولیوم ارزیابی شد. با توجه به شکل 2، اثرات نانو ذرات استفاده شده بر رشد و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی به روشی وابسته به دوز و زمان بود. زمانی که سلول‌ها به مدت 144 ساعت در معرض 1000 میکروگرم در میلی لیتر پلاتین قرار گرفتند، زنده ماندن سلول‌های بنیادی مزانشیمی 50 درصد کاهش یافت. سمیت سلولی نانومواد به گروه‌های عاملی سطحی آن‌ها نسبت داده می‌شود (شکل 2).
شکل (2): تجزیه و تحلیل MTT سمیت سلولی و فعالیت متابولیکی سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از 144 ساعت تیمار با نانو ذرات پلاتین
تأثیر بر پیشرفت چرخه سلولی:
تجزیه و تحلیل چرخه سلول‌های بنیادی تیمار شده با نانو ذرات پلاتین نشان داد که در این سلول‌ها به شدت چرخه سلولی دچار تغییر می‌گردد به نحوی که با افزایش درصد سلول‌های اپاپتوتیک در فاز subG از 25/0 درصد به 1/2 درصد، تجمع سلول‌ها در فاز S از 88/17 درصد در سلول‌های کنترل به 75/46 و 43/23 درصد و کاهش شدید جمعیت سلول‌ها در G0/G1 از 2/60درصد در کنترل به 34درصد و 57درصد در گروه‌های تیمار شده موجب مشکلاتی در چرخه سلولی می‌گردد. که این اثرات هم در غلظت 300 و هم در 800 میکروگرم در میلی لیتر از نانو ذرات پلاتین مشهود است با افزایش دوز شدیدتر می‌باشد. (شکل 3). در واقع، نانو ذرات پلاتین رشد و تکثیر سلولی را در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده کند و مشکل می‌کند.
شکل (3): تجزیه و تحلیل چرخه سلولی سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از تیمار با نانو ذرات پلاتینوم. در مقایسه با گروه کنترل (A) نانو ذرات پلاتین باعث افزایش درصد سلول‌ها در فاز/S در سلول‌های بنیادی مزانشیمی شد که با 300 (B) و 800 (C) میکروگرم تیمار شده‌اند.
نتایج بیان ژن‌های بنیادینگی:
دو ژن اصلی که بیومارکرهای برجسته خود نوسازی و تنظیم کننده اصلی بنیادینگی در سلول‌های بنیادی هستند OCT4 و Sox-2 می‌باشند (32،33). بیان OCT4 ارتباط تنگاتنگی با حفظ پرتوانی در سلول‌های بنیادی دارد و پس از تمایز به سرعت کاهش می‌یابد. تجزیه و تحلیل Real-time PCR نشان داد که بیان Oct4 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با 300 میکروگرم در میلی لیتر از نانو ذرات پلاتین نسبت به گروه کنترل به شدت کاهش یافته است. بعلاوه بیان Sox-2 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده به‌طور مشابه تغییر کرد. در مقایسه با گروه کنترل، بیان Sox-2 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی که با 300 میکروگرم در میلی‌لیتر نانو ذرات پلاتین به مدت 48 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند، به‌طور معنی‌داری کاهش (p<0.05) یافت. نتایج شواهدی را ارائه کردند که نانو ذرات پلاتین بیان ژن‌های بنیادینگی را کاهش می‌دهند (شکل 4).
تجزیه و تحلیل تشکیل کلنی:
تشکیل کلونی که به‌عنوان یکی از مارکرهای بنیادینگی می‌باشد در سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از تیمار با نانو ذرات پلاتینیوم مورد ارزیابی قرار گرفت. مورفولوژی و تعداد کلنی‌های تشکیل‌شده توسط تعداد مشخصی از سلول‌های پیش‌ساز، اطلاعات اساسی در مورد توانایی سلول‌های ورودی برای تکثیر ارائه می‌دهد. نتایج کلون زایی در شکل 4 مشخص شده است که نشان می‌دهد تعداد کلنی‌ها در گروه‌های تیمار شده نسبت به گروه کنترل کاهش دارد (P<0.05). بنابراین نانو ذرات پلاتین توانایی تشکیل کلونی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را به‌ویژه در دوزهای بالاترکم می‌کند.
دو ژن اصلی که بیومارکرهای برجسته خود نوسازی و تنظیم کننده اصلی بنیادینگی در سلول‌های بنیادی هستند OCT4 و Sox-2 می‌باشند (32،33). بیان OCT4 ارتباط تنگاتنگی با حفظ پرتوانی در سلول‌های بنیادی دارد و پس از تمایز به سرعت کاهش می‌یابد. تجزیه و تحلیل Real-time PCR نشان داد که بیان Oct4 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با 300 میکروگرم در میلی لیتر از نانو ذرات پلاتین نسبت به گروه کنترل به شدت کاهش یافته است. بعلاوه بیان Sox-2 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده به‌طور مشابه تغییر کرد. در مقایسه با گروه کنترل، بیان Sox-2 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی که با 300 میکروگرم در میلی‌لیتر نانو ذرات پلاتین به مدت 48 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند، به‌طور معنی‌داری کاهش (p<0.05) یافت. نتایج شواهدی را ارائه کردند که نانو ذرات پلاتین بیان ژن‌های بنیادینگی را کاهش می‌دهند (شکل 4).
تجزیه و تحلیل تشکیل کلنی:
تشکیل کلونی که به‌عنوان یکی از مارکرهای بنیادینگی می‌باشد در سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از تیمار با نانو ذرات پلاتینیوم مورد ارزیابی قرار گرفت. مورفولوژی و تعداد کلنی‌های تشکیل‌شده توسط تعداد مشخصی از سلول‌های پیش‌ساز، اطلاعات اساسی در مورد توانایی سلول‌های ورودی برای تکثیر ارائه می‌دهد. نتایج کلون زایی در شکل 4 مشخص شده است که نشان می‌دهد تعداد کلنی‌ها در گروه‌های تیمار شده نسبت به گروه کنترل کاهش دارد (P<0.05). بنابراین نانو ذرات پلاتین توانایی تشکیل کلونی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را به‌ویژه در دوزهای بالاترکم می‌کند.
شکل (4): بررسی بیان Sox-2 در MSC های تیمار شده با نانو ذرات. نمودارهای (A) بیان Sox-2 و (B) Oct4 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی در گروه کنترل و سلول‌های تیمار شده با ن نانو ذرات پلاتین (0.05 < P) به مدت 48 ساعت. (C) تجزیه و تحلیل تشکیل کلونی سلول‌های بنیادی مزانشیمی
بحث و نتیجه‌گیری
استفاده از آلیاژها و فلزات در دنیای پزشکی بسیار متداول شده است در این میان فلز پلاتین به دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی خاصی که دارد و سبب پایداری آن می‌شود. فلز بسیار پرکاربرد و مفیدی محسوب می‌شود (34). از این ماده و مشتقات آن در درمان سرطان استفاده می‌گردد (35). همچنین در ساخت اقلامی مانند روکش‌های دندان، ابزارها و پین‌های جراحی استفاده می‌گردد. همچنین جهت درمان دیسک کمر، دیسک گردن، ستون فقرات، انواع شکستگی استخوان پا و مچ دست، معمولاً از پلاتین استفاده می‌شود (36). در دهه اخیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی اتولوگ بعنوان منبع بسیار مهمی در مطالعات توکسیسیته متریالها استفاده شده‌اند. به‌ویژه سلول‌های بنیادی مدل حیوانی که از مغز استخوان یا بافت چربی در دسترس و قابل استخراج می‌باشند (37)، سلول‌های بنیادی استخراج شده از مغز استخوان نسبت به انواع دیگر سلول‌ها از مزایای ویژه‌ای برخوردارند و موجب بقای سلول‌های عصبی شده و از آپوپتوز آن‌ها جلوگیری می‌کنند و به این ترتیب باعث بهبود عملکرد آن‌ها می‌شود (38). در مطالعه حاضر، ما اثر نانو ذرات پلاتین را بر روی بنیادینگی (stemness) سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش بررسی کردیم. نانو ذرات پلاتین با اندازه متوسط تقریباً 180 نانومتر و پتانسیل زتا +25.8 شناسایی شدند. پتانسیل زتا که بعنوان یک پارامتراصلی برای مشخص نمودن پایداری سوسپانسیونی نانو ذرات اندازه گیری می‌شود. به‌طور کلی وقتی پایداری نانو ذرات گزارش می‌گردد مقدار پتانسیل زتا بیشتر از 30 میلی ولت پایداری خوب و کمتر از 2 میلی ولت موجب اگرگاسیون و ناپایداری آن‌ها می‌شود (39). پتانسیل زتا برای نانو ذرات این مطالعه +25.8 بود که نشان‌دهنده‌ی پایداری مطلوب نانو ذرات پلاتین است.
پس از ارزیابی سمیت نانو ذرات پلاتین با آزمون MTT، سمیت وابسته به غلظت و زمان این نانو ذرات بر روی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تعیین شد. این نتایج مطابق با یافته‌های یک مطالعه قبلی بود که هر چند در آن سلول‌های بنیادی مطالعه نشدند اما نانو ذرات پلاتینیوم تأثیر منفی بر زنده‌مانی سلول‌های لوکمیا نشان داد (40). تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با نانو ذرات پلاتین افزایش درصد سلول‌ها در فاز S و کاهش سلول‌ها در G0/G1 را نشان داد که نقش منفی این نانو ذرات در مقایسه با گروه کنترل تیمار نشده را نشان می‌دهد. در یک مقاله مشابه که روی سلول‌های سرطانی MCF-7 انجام شد افزایش سلول‌ها در G0/G1 گزارش گردید (45) که احتمالاً به دلیل متغیر بودن شرایط آزمایشات متفاوت از نتیجه این مطالعه است.
از آنجاییکه بسیاری از عملکردهای سلول‌ها با فعالیت ژن‌های آن‌ها انجام و مرتبط است در این مطالعه ارزیابی بیان ژن‌های بنیادی با روش Real-time PCR انجام شد که نشان داد که در سلول‌های تیمار شده، ژن‌های Sox-2 و Oct4 به‌طور معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل سرکوب شدند. در مطالعه دیگری که توسط گروه ما انجام و در سال 2022 چاپ شد نانو ذرات تیتانیوم بر سلول‌های بنیادی انجام شد اثر منفی روی زنده‌مانی سلول‌های بنیادی نشان داد و حتی منجر به پیری گردید (41) که نتایج این مطالعه را تأیید می‌نماید. همچنین مطالعه اثر نانو ذرات اکسید روی بر سلول‌های بنیادی نشان داد که سایز کوچکتر این نانو ذرات تأثیر منفی بیشتر بر زنده‌مانی و خواص بنیادینگی این سلول‌ها دارد که این یافته‌ها در راستای یافته‌های این مطالعه می‌باشد (42). همچنین مطالعه عابد و همکاران نشان داد که استفاده از نانو ذرات پلاتینیوم می‌تواند شدت اثرات ضدسرطانی فوتوترمال را به‌صورت هم افزایی در سلول‌های MCF-7 افزایش دهد (43). در این مطالعه از روش سنتز سبز برای تهیه نانو ذرات پلاتینیوم استفاده شد. در مطالعه دیگری که در سلول‌های MCF-7 انجام شد که باز با روش سبز انجام شد اندازه نانوذره مشابه کار ما بود و پتانسیل زتا هم اندازه گیری شد که معادل -23 بود (44).
در نهایت، یافته‌های ما نشان می‌دهد که نانو ذرات پلاتین می‌توانند تکثیر، چرخه سلولی و خواص بنیادینگی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را کاهش دهند. این یافته‌ها نشان می‌دهد که استفاده در دوزهای بالا و مدت‌زمانهای طولانی ممکن است بتواند باعث ایجاد عوارض احتمالی در سلول‌های بنیادی بیماران باشد.
در این مطالعه امکان بررسی بیشتر اثرات نانو ذرات پلاتنیوم در شرایط درون تن در حیوانات آزمایشگاهی و در انسان میسر نشد که می‌تواند در مطالعات آینده مورد بررسی قرار گیرد. همچنین پیشنهاد می‌شود نظر به اهمیت چک کردن امکان ایجاد کم خونی‌ها، در کارهای آینده مطالعه اثرات این نانو ذرات به‌ویژه اثر دراز مدت آن‌ها بر همولیز و سلول‌های خونی مورد بررسی قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم می‌دانند مراتب تشکر و قدردانی خود را از گروه بیوتکنولوژی پزشکی و دانشکده علوم نوین پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تبریزو همچنین گروه شیمی دانشگاه تبریز به خاطر حمایت‌های معنوی این اثر اظهار دارند.
حمایت مالی تحقیق
این تحقیق توسط معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی تبریز حمایت مالی شده است.
تضاد منافع
نویسندگان هیچ تضاد منافعی اظهار ننمودند.
ملاحضات اخلاقی
این مطالعه دارای مجوز اخلاق با شماره IR.TBZMED.REC.1395.967 از دانشگاه علوم پزشکی تبریز است.
[1] Mesenchymal Stem Cells (MSCs)
نوع مطالعه: پژوهشي(توصیفی- تحلیلی) |
موضوع مقاله:
بیوشیمی
فهرست منابع
1. Wu D, Chang X, Tian J, Kang L, Wu Y, Liu J et al. Bone mesenchymal stem cells stimulation by magnetic nanoparticles and a static magnetic field. release of exosomal miR-1260a improves osteogenesis and angiogenesis. J Nanobiotechnol 2021;19(1):1-19. [DOI:10.1186/s12951-021-00958-6] [PMID] []
2. He F, Cao J, Qi J, Liu Z, Liu G, Deng W. Regulation of Stem Cell Differentiation by Inorganic Nanomaterials. Recent Advances in Regenerative Medicine. Front Bioeng Biotechnol 2021;9(September):1-10. [DOI:10.3389/fbioe.2021.721581] [PMID] []
3. Fu X, Liu G, Halim A, Ju Y, Luo Q, Song G. Mesenchymal Stem Cell Migration and Tissue Repair. Cells 2019;8(8). [DOI:10.3390/cells8080784] [PMID] []
4. Ikono R, Li N, Pratama NH, Vibriani A, Yuniarni DR, Luthfansyah M et al. Enhanced bone regeneration capability of chitosan sponge coated with TiO2 nanoparticles. Bioethanol Rep 2019; 24. [DOI:10.1016/j.btre.2019.e00350] [PMID] []
5. Sun Y, Lu Y, Yin L, Liu Z. The Roles of Nanoparticles in Stem Cell-Based Therapy for Cardiovascular Disease. Front Bioeng Biotechnol 2020;8(August):1-12. [DOI:10.3389/fbioe.2020.00947] [PMID] []
6. Dong Y, Wu X, Chen X, Zhou P, Xu F, Liang W. Nanotechnology shaping stem cell therapy. Recent advances, application, challenges, and future outlook. Biomed. Pharmacother 2021;137(December 2020):111236. [DOI:10.1016/j.biopha.2021.111236] [PMID]
7. Pan S, Yu H, Yang X, Yang X, Wang Y, Liu Q, et al. Application of Nanomaterials in Stem Cell Regenerative Medicine of Orthopedic Surgery. J Nanomater 2017;2017:1985942. [DOI:10.1155/2017/1985942]
8. Huynh KH, Pham XH, Kim J, Lee SH, Chang H, Rho WY et al. Synthesis, properties, and biological applications of metallic alloy nanoparticles. Int J Mol Sci 2020;21(14):1-29. [DOI:10.3390/ijms21145174] [PMID] []
9. Zhang Z, Fu X, Xu L, Hu X, Deng F, Yang Z et al. Nanosized Alumina Particle and Proteasome Inhibitor Bortezomib Prevented inflammation and Osteolysis Induced by Titanium Particle via Autophagy and NF-κB Signaling. Sci Rep 2020;10(1):1-12. [DOI:10.1038/s41598-020-62254-x] [PMID] []
10. Soleimany L, Zare S, Hobbenaghi R, Delirezh N, Hushmandi K. comparison effect of bone marrow derived mesenchymal stem cells and stimulated bone marrow mesenchymal stem cells with LPS on healing of induced third-degree skin burn in mouse. Stud Med Sci 2017;27(11):1012-24. [Google Scholar]
11. Zhang C, Xu C, Gao X, Yao Q. Platinum-based drugs for cancer therapy and anti-tumor strategies. Theranostics 2022;12(5):2115-32. [DOI:10.7150/thno.69424] [PMID] []
12. Moon KS, Choi EJ, Bae JM, Park YB, Oh S. Visible light-enhanced antibacterial and osteogenic functionality of Au and Pt nanoparticles deposited on TiO2 nanotubes. Materials 2020;13(17). [DOI:10.3390/ma13173721] [PMID] []
13. Sathiyaraj G, Vinosha M, Sangeetha D, Manikandakrishnan M, Palanisamy S, Sonaimuthu M et al. Bio-directed synthesis of Pt-nanoparticles from aqueous extract of red algae Halymenia dilatata and their biomedical applications. Colloids Surf. A [Internet]. 2021;618(March):126434. [DOI:10.1016/j.colsurfa.2021.126434]
14. Ramkumar VS, Pugazhendhi A, Prakash S, Ahila NK, Vinoj G, Selvam S et al. Synthesis of platinum nanoparticles using seaweed Padina gymnospora and their catalytic activity as PVP/PtNPs nanocomposite towards biological applications. Biomed Pharmacother 2017; 92:479-90. [DOI:10.1016/j.biopha.2017.05.076] [PMID]
15. Selvi AM, Palanisamy S, Jeyanthi S, Vinosha M, Mohandoss S, Tabarsa M et al. Synthesis of Tragia involucrata mediated platinum nanoparticles for comprehensive therapeutic applications: Antioxidant, antibacterial and mitochondria-associated apoptosis in HeLa cells. Process Biochem 2020; 98:21-33. [DOI:10.1016/j.procbio.2020.07.008]
16. Lee J-W, Son J, Yoo K-M, Lo YM, Moon B. Characterization of the antioxidant activity of gold@platinum nanoparticles. RSC Adv 2014;4(38):19824-30. [DOI:10.1039/c4ra01765j]
17. Zheng B, Kong T, Jing X, Odoom-Wubah T, Li X, Sun D et al. Plant-mediated synthesis of platinum nanoparticles and its bioreductive mechanism. J. Colloid Interface Sci 2013;396:138-45. [DOI:10.1016/j.jcis.2013.01.021] [PMID]
18. Rehman MU, Yoshihisa Y, Miyamoto Y, Shimizu T. The anti-inflammatory effects of platinum nanoparticles on the lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW 264.7 macrophages. Inflammation Res 2012;61:1177-85. [DOI:10.1007/s00011-012-0512-0] [PMID]
19. Tan L, Liu X, Dou H, Hou Y. ScienceDirect Characteristics and regulation of mesenchymal stem cell plasticity by the microenvironment d specific factors involved in the regulation of MSC plasticity. Genes Dis 2020. [Google Scholar]
20. Moosavi MA, Moghtaran Bonab N, Hoseinpour Feizi MA, Asvadi Kermani I. study the effect of nucleostemin gene silencing by sirna on growth inhibition and differentiation in NB4 promyelocytic leukemia cell line. Stud Med Sci 2013;24(2):121-32. [Google Scholar]
21. Heib T, Gross C, Müller ML, Stegner D, Pleines I. Isolation of murine bone marrow by centrifugation or flushing for the analysis of hematopoietic cells-a comparative study. Platelets 2021;32(5):601-7. [DOI:10.1080/09537104.2020.1797323] [PMID]
22. Gurunathan S, Jeyaraj M, La H, Yoo H, Choi Y, Do JT et al. Anisotropic Platinum Nanoparticle-Induced Cytotoxicity, Apoptosis, Inflammatory Response, and Transcriptomic and Molecular Pathways in Human Acute Monocytic Leukemia Cells. Int J Mol Sci 2020;21(2):440. [DOI:10.3390/ijms21020440] [PMID] []
23. Long NV, Chien ND, Hayakawa T, Hirata H, Lakshminarayana G, Nogami M. The synthesis and characterization of platinum nanoparticles: a method of controlling the size and morphology. Nanotechnology 2009;21(3):035605. [DOI:10.1088/0957-4484/21/3/035605] [PMID]
24. Rahman MS, Akhter S, Ahmed KN, Rahman MS, Saha RK, Hossain MJ. Tunable synthesis of platinum nanoparticles by EtOH reduction in presence of poly (vinylpyrrolidone). Bangladesh J Sci Ind Res 2015;50(2):87-92. [DOI:10.3329/bjsir.v50i2.24349]
25. Hassanlou L, Meshgini S, Alizadeh E. Evaluating adipocyte differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a deep learning method for automatic lipid droplet counting. Comput Biol Med 2019;112(207). [DOI:10.1016/j.compbiomed.2019.103365] [PMID]
26. Goldman SM, Henderson BEP, Corona BT. Evaluation of bone marrow mononuclear cells as an adjunct therapy to minced muscle graft for the treatment of volumetric muscle loss injuries. Stem Cell Res Ther 2017;8(1):1-6. [DOI:10.1186/s13287-017-0589-z] [PMID] []
27. Hashemi F, Heidari F, Mohajeri N, Zarghami N. Fluorescence Intensity Enhancement of Green Carbon Dots : Synthesis, Characterization Cell Imaging Photochem Photobiol 2020 [DOI:10.1111/php.13261] [PMID]
28. (18):1-9. 28. F. Pouremamali, F. Jeddi NS. Nrf2-ME-1 axis is associated with 5-FU resistance in gastric cancer cell line. Process Biochem 2020. [Google Scholar]
29. Arezoumand KS, Alizadeh E, Esmaeillou M, Ghasemi M, Alipour S, Pilehvar-Soltanahmadi Y et al. The emu oil emulsified in egg lecithin and butylated hydroxytoluene enhanced the proliferation, stemness gene expression, and in vitro wound healing of adipose-derived stem cells. Vitr Cell Dev Biol - Anim 2018;54(3):205-16. [DOI:10.1007/s11626-018-0228-8] [PMID]
30. Asadi M, Lotfi H, Salehi R, Mehdipour A, Zarghami N, Akbarzadeh A, et al. Hepatic cell-sheet fabrication of differentiated mesenchymal stem cells using decellularized extracellular matrix and thermoresponsive polymer. Biomed Pharmacother 2021;134(July 2020):111096. [DOI:10.1016/j.biopha.2020.111096] [PMID]
31. Xu J, Zhang Y, Xu J, Wang M, Liu G, Wang J et al. Reversing tumor stemness via orally targeted nanoparticles achieves efficient colon cancer treatment. Biomaterials 2019;216(June):119247. [DOI:10.1016/j.biomaterials.2019.119247] [PMID]
32. Heurtier V, Owens N, Gonzalez I, Mueller F, Proux C, Mornico D et al. The molecular logic of Sox-2-induced self-renewal in mouse embryonic stem cells. Nat Commun 2019;10(1). [DOI:10.1038/s41467-019-09041-z] [PMID] []
33. Rajanahalli P, Stucke CJ, Hong Y. The effects of silver nanoparticles on mouse embryonic stem cell self-renewal and proliferation. Toxicol Rep 2015; 2:758-64. [DOI:10.1016/j.toxrep.2015.05.005] [PMID] []
34. Cowley A. A healthy future: platinum in medical applications. Platinum Met Rev 2011;55(2):98-107. [DOI:10.1595/147106711X566816]
35. Zhang C, Xu C, Gao X, Yao Q. Platinum-based drugs for cancer therapy and anti-tumor strategies. Theranostics 2022;12(5):2115. [DOI:10.7150/thno.69424] [PMID] []
36. Wang Z, Wang J, Liu J, Zhang Y, Zhang J, Yang R et al. Platinum nanoparticles enhance osteogenic differentiation of human dental follicle stem cells via scavenging ROS. Smart Mater Med 2023. [DOI:10.1016/j.smaim.2023.06.004]
37. Sarikhani M, Vaghefi Moghaddam S, Firouzamandi M, Hejazy M, Rahimi B, Moeini H, Alizadeh E. Harnessing rat derived model cells to assess the toxicity of TiO2 nanoparticles. J Mater Sci Mater Med. 2022;33(5):41. [DOI:10.1007/s10856-022-06662-7] [PMID] []
38. Pourheydar B, Shahi M, Farjah GH, Javanmard M, Karimipour M, Atabaki F. Evaluation of apoptosis in hippocampal cells of rat following intravenous injection of bone marrow stromal cells in ischemia-reperfusion model. Stud Med Sci 2014; 25(7):586-97. [Google Scholar]
39. Maleki Dizaj S, Lotfipour F, Barzegar-Jalali M, Zarrintan MH, Adibkia K. Ciprofloxacin HCl-loaded calcium carbonate nanoparticles: preparation, solid state characterization, and evaluation of antimicrobial effect against Staphylococcus aureus. Artif Cells Nanomed Biotechnol 2017;45(3):535-543. [DOI:10.3109/21691401.2016.1161637] [PMID]
40. Gurunathan S, Jeyaraj M, La H, Yoo H, Choi Y, Do JT et al. Anisotropic platinum nanoparticle-induced cytotoxicity, apoptosis, inflammatory response, and transcriptomic and molecular pathways in human acute monocytic leukemia cells. Int J Mol Sci 2020;21(2):440. [DOI:10.3390/ijms21020440] [PMID] []
41. Sarikhani M, Vaghefi Moghaddam S, Firouzamandi M, Hejazy M, Rahimi B, Moeini H et al. Harnessing rat derived model cells to assess the toxicity of TiO2 nanoparticles. J Mater Sci Mater Med 2022;33(5):41. [DOI:10.1007/s10856-022-06662-7] [PMID] []
42. Deylam M, Alizadeh E, Sarikhani M, Hejazy M, Firouzamandi M. Zinc oxide nanoparticles promote the aging process in a size-dependent manner. J Mater Sci Mater Med 2021;32:1-0. [DOI:10.1007/s10856-021-06602-x] [PMID] []
43. Abed, A. S., Mishaal Mohammed, A., & Khalaf, Y. H. (2022). Novel photothermal therapy using platinum nanoparticles in synergy with near-infrared radiation (NIR) against human breast cancer MCF-7 cell line. [DOI:10.1016/j.rechem.2022.100591]
44. Manzoor S, Bashir DJ, Imtiyaz K, Rizvi MMA, Ahamad I, Fatma T, Agarwal NB, Arora I, Samim M. Biofabricated platinum nanoparticles: therapeutic evaluation as a potential nanodrug against breast cancer cells and drug-resistant bacteria. RSC Adv 2021;11(40):24900-24916. [DOI:10.1039/D1RA03133C] [PMID] []
45. Alyami NM, Almeer R, Alyami HM. Role of green synthesized platinum nanoparticles in cytotoxicity, oxidative stress, and apoptosis of human colon cancer cells (HCT-116). Heliyon 2022;8(12):e11917. [DOI:10.1016/j.heliyon.2022.e11917] [PMID] []
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
