دوره 34، شماره 5 - ( مرداد 1402 )
جلد 34 شماره 5 صفحات 258-247 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Research code: 20195
Ethics code: IR.SUMS.MED.REC.1399.193
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mehdipour F, Mirshahi A, Hoseini A, Mirshahi M, Ghaderi A. PRODUCTION AND PURIFICATION OF RABBIT ANTI-CD166 POLYCLONAL ANTIBODY. Studies in Medical Sciences 2023; 34 (5) :247-258
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-6032-fa.html
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-6032-fa.html
مهدی پور فرشته، میرشاهی آرتین، حسینی احمد، میرشاهی منوچهر، قادری عباس. تولید و خالص‌سازی آنتی‌بادی پلی کلونال علیه مولکول CD166 خرگوش. مجله مطالعات علوم پزشکی. 1402; 34 (5) :247-258
استاد ایمنی شناسی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، شیراز، ایران (نویسنده مسئول) ، ghaderia@sums.ac.ir
متن کامل [PDF 794 kb]
(788 دریافت)
| چکیده (HTML) (1021 مشاهده)
مواد و روش کار
حیوان مورد استفاده:
تعیین خلوص آنتیبادیها به روش الکتروفورز SDS-PAGE:
در این روش، جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اختلاف وزن مولکولی صورت می‌گیرد (27, 28). برای این کار ابتدا ژل% 5/12 آکریل آمید آماده شد وسپس 30 میکرولیتر از هر نمونه که با بافر لودینگ حاوی SDS (Merck) و DTT, GE Healthcare)، آمریکا) مخلوط شده بود به همراه مارکر لدر در چاهک‌ها ریختیم. الکتروفورز با ولتاژ 120 ولت تا رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل انجام گرفت. سپس ژل را از دستگاه الکتروفورز جدا کرده و به مدت یک شب در رنگ کوماسی به لو قرار دادیم. دراخر هم توسط آب مقطر رنگ زدایی از ژل انجام شد (26, 27).
یافته‌ها
سنجش غلظت آنتی‌بادی در سرم خرگوش‌های ایمن شده:
بعد از ایمن کردن خرگوش‌ها و تزریق بوستر در فواصل زمانی مشخص و سپس خونگیری و جدا کردن سرم ها, از تست الایزا برای تأیید وجود آنتی‌بادی علیه پپتید CD166 استفاده کردیم. همانگونه که در شکل 1 نشان داده شده است, تزریق در روزهای 0, 14, 28, 49, 83, 200 و 300 انجام شده و خرگوش‌ها طی ایمونیزاسیون های متوالی, علیه پپتید CD166 آنتی‌بادی تولید کرده‌اند. در شکل 2 نیز غلظت آنتی‌بادی خرگوش کنترل (خرگوشی که ایمن نشده) و خرگوش ایمن شده مقایسه شده است. در شکل 3 نیز نتایج تست الایزا پس از تزریق هشتم نشان داده شده است.
.jpg)
خالص‌سازی آنتی‌بادی‌های خرگوش و اندازه گیری غلظت آنتی‌بادی‌های خالص شده:
بحث و نتیجه‌گیری
در این مطالعه تلاش شد که علیه قسمتی از بخش خارج سلولی مولکول CD166 آنتی‌بادی پلی کلونال تهیه شود. اگرچه آنتی‌بادی تولیدی تیتر پاِئینی داشته و بخش زیادی از آنتی‌بادی تولید شده علیه قسمت اتصال پپتید به KLH بود. کوچک و سنتتیک بودن پپتید می‌تواند عامل تولید کم آنتی‌بادی علیه آن باشد.
پیشنهادات
استفاده از یک قطعه بزرگتر پپتیدی مانند بخش خارج سلولی مولکول CD166 به‌عنوان ایمیونوژن تزریقی می‌تواند به رفع این مشکل کمک کند. همچنین استفاده از آلبومین گاوی به‌عنوان پروتئین حامل به جای KLH ممکن است سبب بهبود تولید آنتی‌بادی شود.
تعارض منافع: نویسندگان مقاله اظهار می‌دارند که مطالعه حاضر هیچگونه تعارض منافعی ندارد.
تشکر و قدردانی
این طرح تحقیقاتی توسط دانشگاه علوم پزشکی شیراز (شماره گرنت 20195) و مرکز تحقیقات سرطان شیراز (شماره گرنت ICR-100-508) حمایت مالی شده است. لازم به ذکر است که این طرح، به‌عنوان پایان نامه آترین میرشاهی دانشجوی دکترای حرفه‌ای پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شیراز انجام شده است.
متن کامل: (354 مشاهده)
مقدمه
مولکول چسبندگی لکوسیت فعال (Activated leukocyte adhesion cell-ALCAM) که تحت عنوان CD166 شناخته می‌شود، برای اولین بار به‌عنوان لیگاند CD6 موجود روی لکوسیت‌ها شناسایی و معرفی شد. CD166 گلیکوپروتئینی است از خانواده ایمنوگلوبولین ها که از 5 دومین خارج سلولی متشکل از 500 اسید آمینه شامل دو دومین متغیر V1 و V2 (Variable domain) و سه دومین ثابت C1, C2 و C3 (Constant domain), یک دومین داخل غشایی با 22 اسید آمینه و یک دومین داخل سیتوپلاسمی با 34 اسید آمینه تشکیل شده است (1, 2). یکی از خصوصیات این مولکول آن است که توالی اسیدآمینه آن به‌خصوص در بخشی از آن که به CD6 متصل می‌شود در بین پستانداران بسیار شبیه هم است (3).
CD166 در سطح لکوسیت های فعال، سلولهای بنیادی خون ساز و پیش ساز های سلولهای لنفوئیدی وجود دارد. علاوه بر بیان CD166 در سلولهای خونی، این مولکول در سلولهای عصبی، مغز استخوان و سلولهای بنیادی مزانشیمی نیز یافت می‌شود (4, 5). CD166 در سطح سلولهای دیگری مانند فیبروبلاست ها, سلولهای کبدی، عصبی و سلولهای اپیتلیال نیز بیان می‌شود (6). علاوه بر نقش CD166 به‌عنوان یک مولکول چسبان در ملانوما، این مولکول در سلولهای بنیادی سرطان مانند سرطان روده بزرگ، پانکراس، ریه، تخمدان و سرطان پستان نیز یافت می‌گردد (7-12). CD166 برای زنده ماندن، حرکت، رشد و همچنین تهاجم طی متاستاز و پیشرفت تومور مهم است. بیان بیش از حد، از بین رفتن و یا اختلال در عملکرد CD166 می‌تواند در جدا شدن سلول توموری و در نتیجه تهاجم به بافت های اطراف و پیشرفت تومور نقش داشته باشد (13). می‌توان از CD166 به‌عنوان مارکری در شناسایی و تعیین روند پیشرفت سرطان استفاده کرد. به‌طور مثال تجمع سیتوپلاسمی ALCAM در سلولهای سنگفرشی حفره دهان نشان‌دهنده پیش آگهی بد بیماری است (14). از طرفی در برخی دیگر از سلولهای سرطانی مثل سرطان اپیتلیال تخمدان, کاهش یا از بین رفتن ALCAM روی غشا نشان‌دهنده پیش آگهی بد است (15). از CD166 می‌توان به‌عنوان مارکر غشایی در شناسایی سرطانهای روده بزگ، ریه، پستان، مری، مثانه، کبد، تخمدان، حلق و بینی و پانکراس استفاده کرد (9, 16, 17). برای شناسایی و تعیین میزان بیان این مولکول در سطح سلولهای لکوسیتی، مزانشیمی و یا سرطانی و استفاده آر این مارکر برای تعیین پیش آگهی تومور نیاز به آنتی‌بادی مونوکلونال یا پلی کلونال اختصاصی می‌باشد.
آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، مولکول‌هایی با ویژگی، افینیتی و فعالیت بیولوژیک یکسان هستند در حالی که آنتی‌بادی‌های پلی کلونال مخلوطی از آنتیبادیها هستند که بر ضد آنتی‌ژن‌های مستقل و اپی توپ‌های متعدد یک آنتی‌ژن، واکنش نشان می‌دهند. همچنین تمایل (افینیتی) آنتی‌بادی‌های پلی کلونال نسبت به یک شاخص آنتی‌ژنی (اپی توپ) متفاوت می‌باشد و از آنجا که مشتمل بر کلاس‌های متفاوت آنتی‌بادی می‌باشند فعالیت‌های بیولوژیکی متفاوتی را هم بروز می‌دهند (18, 19). آنتی‌بادی‌های پلی کلونال می‌توانند بسیار سریعتر، با هزینه کمتر و با مهارت فنی کمتری نسبت به آنتی‌بادی‌های مونوکلونال تولید شوند (20). آنتی‌بادی‌های پلی کلونال غالباً واکنش بهتری نسبت به آنتی‌بادی‌های مونوکلونال دارند زیرا توسط تعداد زیادی کلون سلول B تولید می‌شوند. آنتی‌بادی‌های پلی کلونال ناهمگن هستند و اپی توپ‌های مختلف آنتی‌ژن میزبان را تشخیص می‌دهند و تغییر یک یا گروه کوچکی از شاخص‌های آنتی‌ژنی تأثیر چشمگیری در شناسایی آنتی‌بادی‌های پلی کلونال نمی‌گذارد (21-23). برای ساخت آنتی‌بادی پلی کلونال از حیوانات مختلفی ازجمله خرگوش، بز، اسب و الاغ می‌توان استفاده کرد (24) خرگوش جزء پر مصرف‌ترین حیوانات در در زمینه تولید آنتی‌بادی می‌باشد. این حیوان دارای ویژگی‌هایی ازجمله اندازه و طول عمر مناسب (6-5 سال)، کنترل راحت، خون گیری آسان و تولید آنتی‌بادی به میزان کافی و حساسیت بالا است. خرگوش‌ها تنها یک نوع کلاس IgG دارند (بدون زیر کلاس دیگری) و این بدان معناست که آنتی‌بادی‌های IgG در خرگوش، ناحیه Fc قابل پیش‌بینی دارند که می‌توان از این ویژگی در اتصال به پروتئینهای G و A استفاده کرد (24, 25).
با توجه به اهمیت مارکر CD166 در تشخیص و پیگیری روند سرطان و همچنین شناسایی سلولهای بنیادی مزانشیمی، پژوهش حاضر انجام شد تا آنتی‌بادی پلی کلونال خرگوش ضد اپی توپی از این مولکول که در بخش خارج سلولی آن قرار دارد، تولید گردد.
CD166 در سطح لکوسیت های فعال، سلولهای بنیادی خون ساز و پیش ساز های سلولهای لنفوئیدی وجود دارد. علاوه بر بیان CD166 در سلولهای خونی، این مولکول در سلولهای عصبی، مغز استخوان و سلولهای بنیادی مزانشیمی نیز یافت می‌شود (4, 5). CD166 در سطح سلولهای دیگری مانند فیبروبلاست ها, سلولهای کبدی، عصبی و سلولهای اپیتلیال نیز بیان می‌شود (6). علاوه بر نقش CD166 به‌عنوان یک مولکول چسبان در ملانوما، این مولکول در سلولهای بنیادی سرطان مانند سرطان روده بزرگ، پانکراس، ریه، تخمدان و سرطان پستان نیز یافت می‌گردد (7-12). CD166 برای زنده ماندن، حرکت، رشد و همچنین تهاجم طی متاستاز و پیشرفت تومور مهم است. بیان بیش از حد، از بین رفتن و یا اختلال در عملکرد CD166 می‌تواند در جدا شدن سلول توموری و در نتیجه تهاجم به بافت های اطراف و پیشرفت تومور نقش داشته باشد (13). می‌توان از CD166 به‌عنوان مارکری در شناسایی و تعیین روند پیشرفت سرطان استفاده کرد. به‌طور مثال تجمع سیتوپلاسمی ALCAM در سلولهای سنگفرشی حفره دهان نشان‌دهنده پیش آگهی بد بیماری است (14). از طرفی در برخی دیگر از سلولهای سرطانی مثل سرطان اپیتلیال تخمدان, کاهش یا از بین رفتن ALCAM روی غشا نشان‌دهنده پیش آگهی بد است (15). از CD166 می‌توان به‌عنوان مارکر غشایی در شناسایی سرطانهای روده بزگ، ریه، پستان، مری، مثانه، کبد، تخمدان، حلق و بینی و پانکراس استفاده کرد (9, 16, 17). برای شناسایی و تعیین میزان بیان این مولکول در سطح سلولهای لکوسیتی، مزانشیمی و یا سرطانی و استفاده آر این مارکر برای تعیین پیش آگهی تومور نیاز به آنتی‌بادی مونوکلونال یا پلی کلونال اختصاصی می‌باشد.
آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، مولکول‌هایی با ویژگی، افینیتی و فعالیت بیولوژیک یکسان هستند در حالی که آنتی‌بادی‌های پلی کلونال مخلوطی از آنتیبادیها هستند که بر ضد آنتی‌ژن‌های مستقل و اپی توپ‌های متعدد یک آنتی‌ژن، واکنش نشان می‌دهند. همچنین تمایل (افینیتی) آنتی‌بادی‌های پلی کلونال نسبت به یک شاخص آنتی‌ژنی (اپی توپ) متفاوت می‌باشد و از آنجا که مشتمل بر کلاس‌های متفاوت آنتی‌بادی می‌باشند فعالیت‌های بیولوژیکی متفاوتی را هم بروز می‌دهند (18, 19). آنتی‌بادی‌های پلی کلونال می‌توانند بسیار سریعتر، با هزینه کمتر و با مهارت فنی کمتری نسبت به آنتی‌بادی‌های مونوکلونال تولید شوند (20). آنتی‌بادی‌های پلی کلونال غالباً واکنش بهتری نسبت به آنتی‌بادی‌های مونوکلونال دارند زیرا توسط تعداد زیادی کلون سلول B تولید می‌شوند. آنتی‌بادی‌های پلی کلونال ناهمگن هستند و اپی توپ‌های مختلف آنتی‌ژن میزبان را تشخیص می‌دهند و تغییر یک یا گروه کوچکی از شاخص‌های آنتی‌ژنی تأثیر چشمگیری در شناسایی آنتی‌بادی‌های پلی کلونال نمی‌گذارد (21-23). برای ساخت آنتی‌بادی پلی کلونال از حیوانات مختلفی ازجمله خرگوش، بز، اسب و الاغ می‌توان استفاده کرد (24) خرگوش جزء پر مصرف‌ترین حیوانات در در زمینه تولید آنتی‌بادی می‌باشد. این حیوان دارای ویژگی‌هایی ازجمله اندازه و طول عمر مناسب (6-5 سال)، کنترل راحت، خون گیری آسان و تولید آنتی‌بادی به میزان کافی و حساسیت بالا است. خرگوش‌ها تنها یک نوع کلاس IgG دارند (بدون زیر کلاس دیگری) و این بدان معناست که آنتی‌بادی‌های IgG در خرگوش، ناحیه Fc قابل پیش‌بینی دارند که می‌توان از این ویژگی در اتصال به پروتئینهای G و A استفاده کرد (24, 25).
با توجه به اهمیت مارکر CD166 در تشخیص و پیگیری روند سرطان و همچنین شناسایی سلولهای بنیادی مزانشیمی، پژوهش حاضر انجام شد تا آنتی‌بادی پلی کلونال خرگوش ضد اپی توپی از این مولکول که در بخش خارج سلولی آن قرار دارد، تولید گردد.
مواد و روش کار
حیوان مورد استفاده:
بنابراین در این مطالعه از دو خرگوش برای تزریق پپتید و به دست آوردن آنتی‌بادی و یک خرگوش به‌عنوان کنترل (بدون تزریق) استفاده شد.
انتخاب پپتید:
برای ایمن کردن خرگوش‌ها نیاز بود ناحیه‌ی مشخصی از مولکول CD166 انتخاب شود. بعد از بررسی مقالات, توالی مورد نظر از پپتید CD166 بر اساس امتیازنامه‌ای (patent) که مربوط به تولید آنتی‌بادی مونوکلونال علیه CD166 پرندگان بود انتخاب شده (شماره امتیاز نامه: (US2009/0269787A1 و این توالی سنتز Genosphere Biotechnologies)، فرانسه) و به خرگوش تزریق شد. توالی اسید آمینه در این پپتید به‌صورت زیر بود: 1 آلانین لوسین پرولین والین سرین سیستئین ترئونین ایزولوسین سرین سرین سرین آرژینین آسپارژین آلانین ترئونین والین فنیل آلانین تریپتوفان ایزولوسین 20 لیزین. توالی نظیر آن در انسان به‌صورت 1 آلانین لوسین پرولین والین سرین سیستئین ترئونین ایزولوسین سرین آلانین سرین آرژینین آسپارژین آلانین ترئونین والین والین تریپتوفان متیونین 20 لیزین است که دارای 3 تفاوت در اسیدآمینه‌های شماره 10، 17 و 19 با پپتید تزریقی می‌باشد. لازم به ذکر است که در امتیازنامه مربوطه ذکر شده بود که آنتی‌بادی تولید شده به CD166 انسانی نیز متصل می‌شود.
تزریق پپتید هدف به خرگوش:
پپتیدهای کوچک ایمینوژن های ضعیفی هستند، بنابراین برای افزایش قدرت ایمنی زایی پپتید CD166، این پپتید به پروتئین Keyhole limpet hemocyanin (KLH) Sigma)، آمریکا) متصل گردید (26). تولیدی نخستین تزریق پپتید CD166 متصل به KLH به همراه ادجوانت کامل فروند (Sigma) به‌صورت زیرجلدی انجام شد و تزریق مجدد پس از گذشت 2 هفته از تزریق اول، به همراه ادجوانت ناقص فروند (Sigma) صورت گرفت (26, 27). خون گیری قبل از هر تزریق به فاصله هر سه هفته با سر سوزن انسولین از قلب خرگوش انجام شد. جهت جداسازی سرم، ابتدا خون را به مدت 1-2 ساعت در دمای اتاق گذاشته و سپس لوله‌ها را با دور rpm 3500 به مدت 20-15 دقیقه سانتریفیوژ نمودیم. سرم ها جدا و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
بررسی واکنشهای ایمنی زایی در خرگوش:
پس از تزریق آنتی‌ژن، آنتی‌بادی تولید شده با روش الایزای غیرمستقیم بررسی شد. از سرم خرگوش به‌عنوان آنتی‌بادی اولیه و از Goat Anti Rabbit Poly HRP Sina Biotech)، ایران) به‌عنوان آنتی‌بادی ثانویه استفاده شد. برای هر خرگوش، غلظت 1µg/ml از پپتید CD166 را در بافر پوشش دهی (coating buffer) تهیه و 100µL از آن در چاهک‌های تعیین شده ریخته و 18 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد تا به کف چاهک بچسبد. پس از دو بار شست و شو، مسدودسازی (blocking) با افزودن 100µL از محلول بلاکینگ ((PBS-Tween20 -10mg/ml BSA (هر دو از Sigma) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. سپس، چاهک‌ها تخلیه شدند و پس از دوبار شستشو رقت‌های مختلفی از سرم خرگوش در بافر بلاکینگ تهیه و 100µL از آن به هر چاهک اضافه و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد و پس از آن سه بار شست و شو داده شد. با استفاده از بافر بلاکینگ رقت 1/5000 از آنتی‌بادی Goat Anti Rabbit Poly HRP تهیه و 100µL از آن به تمامی چاهک‌ها اضافه و 1 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد. پس از 4 بار شست و شو, 100µL از محلول TMB به تمامی چاهک‌ها اضافه و پلیت در تاریکی قرار داده شد. پس از 10 دقیقه تغییر رنگ آبی حاصل و واکنش با افزودن محلول مخصوص توقف واکنش، متوقف و خوانش در طول موج 450 نانومتر انجام شد. تمام شستشوها با %05/0 PBS-Tween20 انجام شد (26, 27).
رسوب دهی آنتی‌بادی با استفاده از آمونیوم سولفات:
از خاصیت آمونیوم سولفات Merck)، آلمان) برای رسوب دادن IgG های خرگوش استفاده کردیم. اضافه کردن این نمک با غلظت اشباع به محلول حاوی پروتئین باعث حذف مولکول‌های آب از محیط شده در نتیجه باعث رسوب پروتئین‌ها می‌شود (26). محلول حاوی IgG های خرگوش و محلول آمونیوم سولفات را به نسبت 55% به 45% ازنظر حجمی با هم مخلوط کردیم و به مدت حداقل 8 ساعت در دمای 4 درجه‌ی سانتیگراد نگه داری نموده تا IgG های خرگوش کامل ته نشین شوند.
تخلیص آنتیبادیها به روش کروماتوگرافی تمایلی به‌وسیله پروتئین G:
ابتدا ستون با ml 5 از ژل سفارز پروتئین G آماده شده و سپس با ml 50 محلول PBS شست و شو و با محلول تعادل سازی به تعادل رسانده شد. مقدار ml 5 از سرم خرگوش سانتریفیوژ و سپس از فیلتر 0.4 میکرومتری عبور داده شد. سرم صاف شده روی ستون سفارز پروتئین G بارگذاری شد. سپس برای خروج مواد اضافی و پروتئینهای متصل نشده، ستون با بافر متعادل سازی شستشو شد تا زمانیکه جذب نوری محلول خروجی در طول موج 280 نانومتر به صفر رسید. پس از آن ستون با بافرشستشو (گلایسین-HCl) مجاور شد و خروجی ستون در حجمهای 1 میلی‌لیتر جمع‌آوری گردید و pH آن به‌وسیله تریس 1 مولار تصحیح شده و به pH فیزیولوژیک رسانده شد. جذب نمونه‌ها پس از دیالیز در 280 نانومتر اندازه‌گیری و با استفاده از فرمول بیر-لامبرت) (A=ɛ Cl تعیین غلظت گردید (26, 27).
انتخاب پپتید:
برای ایمن کردن خرگوش‌ها نیاز بود ناحیه‌ی مشخصی از مولکول CD166 انتخاب شود. بعد از بررسی مقالات, توالی مورد نظر از پپتید CD166 بر اساس امتیازنامه‌ای (patent) که مربوط به تولید آنتی‌بادی مونوکلونال علیه CD166 پرندگان بود انتخاب شده (شماره امتیاز نامه: (US2009/0269787A1 و این توالی سنتز Genosphere Biotechnologies)، فرانسه) و به خرگوش تزریق شد. توالی اسید آمینه در این پپتید به‌صورت زیر بود: 1 آلانین لوسین پرولین والین سرین سیستئین ترئونین ایزولوسین سرین سرین سرین آرژینین آسپارژین آلانین ترئونین والین فنیل آلانین تریپتوفان ایزولوسین 20 لیزین. توالی نظیر آن در انسان به‌صورت 1 آلانین لوسین پرولین والین سرین سیستئین ترئونین ایزولوسین سرین آلانین سرین آرژینین آسپارژین آلانین ترئونین والین والین تریپتوفان متیونین 20 لیزین است که دارای 3 تفاوت در اسیدآمینه‌های شماره 10، 17 و 19 با پپتید تزریقی می‌باشد. لازم به ذکر است که در امتیازنامه مربوطه ذکر شده بود که آنتی‌بادی تولید شده به CD166 انسانی نیز متصل می‌شود.
تزریق پپتید هدف به خرگوش:
پپتیدهای کوچک ایمینوژن های ضعیفی هستند، بنابراین برای افزایش قدرت ایمنی زایی پپتید CD166، این پپتید به پروتئین Keyhole limpet hemocyanin (KLH) Sigma)، آمریکا) متصل گردید (26). تولیدی نخستین تزریق پپتید CD166 متصل به KLH به همراه ادجوانت کامل فروند (Sigma) به‌صورت زیرجلدی انجام شد و تزریق مجدد پس از گذشت 2 هفته از تزریق اول، به همراه ادجوانت ناقص فروند (Sigma) صورت گرفت (26, 27). خون گیری قبل از هر تزریق به فاصله هر سه هفته با سر سوزن انسولین از قلب خرگوش انجام شد. جهت جداسازی سرم، ابتدا خون را به مدت 1-2 ساعت در دمای اتاق گذاشته و سپس لوله‌ها را با دور rpm 3500 به مدت 20-15 دقیقه سانتریفیوژ نمودیم. سرم ها جدا و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
بررسی واکنشهای ایمنی زایی در خرگوش:
پس از تزریق آنتی‌ژن، آنتی‌بادی تولید شده با روش الایزای غیرمستقیم بررسی شد. از سرم خرگوش به‌عنوان آنتی‌بادی اولیه و از Goat Anti Rabbit Poly HRP Sina Biotech)، ایران) به‌عنوان آنتی‌بادی ثانویه استفاده شد. برای هر خرگوش، غلظت 1µg/ml از پپتید CD166 را در بافر پوشش دهی (coating buffer) تهیه و 100µL از آن در چاهک‌های تعیین شده ریخته و 18 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد تا به کف چاهک بچسبد. پس از دو بار شست و شو، مسدودسازی (blocking) با افزودن 100µL از محلول بلاکینگ ((PBS-Tween20 -10mg/ml BSA (هر دو از Sigma) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. سپس، چاهک‌ها تخلیه شدند و پس از دوبار شستشو رقت‌های مختلفی از سرم خرگوش در بافر بلاکینگ تهیه و 100µL از آن به هر چاهک اضافه و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد و پس از آن سه بار شست و شو داده شد. با استفاده از بافر بلاکینگ رقت 1/5000 از آنتی‌بادی Goat Anti Rabbit Poly HRP تهیه و 100µL از آن به تمامی چاهک‌ها اضافه و 1 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد. پس از 4 بار شست و شو, 100µL از محلول TMB به تمامی چاهک‌ها اضافه و پلیت در تاریکی قرار داده شد. پس از 10 دقیقه تغییر رنگ آبی حاصل و واکنش با افزودن محلول مخصوص توقف واکنش، متوقف و خوانش در طول موج 450 نانومتر انجام شد. تمام شستشوها با %05/0 PBS-Tween20 انجام شد (26, 27).
رسوب دهی آنتی‌بادی با استفاده از آمونیوم سولفات:
از خاصیت آمونیوم سولفات Merck)، آلمان) برای رسوب دادن IgG های خرگوش استفاده کردیم. اضافه کردن این نمک با غلظت اشباع به محلول حاوی پروتئین باعث حذف مولکول‌های آب از محیط شده در نتیجه باعث رسوب پروتئین‌ها می‌شود (26). محلول حاوی IgG های خرگوش و محلول آمونیوم سولفات را به نسبت 55% به 45% ازنظر حجمی با هم مخلوط کردیم و به مدت حداقل 8 ساعت در دمای 4 درجه‌ی سانتیگراد نگه داری نموده تا IgG های خرگوش کامل ته نشین شوند.
تخلیص آنتیبادیها به روش کروماتوگرافی تمایلی به‌وسیله پروتئین G:
ابتدا ستون با ml 5 از ژل سفارز پروتئین G آماده شده و سپس با ml 50 محلول PBS شست و شو و با محلول تعادل سازی به تعادل رسانده شد. مقدار ml 5 از سرم خرگوش سانتریفیوژ و سپس از فیلتر 0.4 میکرومتری عبور داده شد. سرم صاف شده روی ستون سفارز پروتئین G بارگذاری شد. سپس برای خروج مواد اضافی و پروتئینهای متصل نشده، ستون با بافر متعادل سازی شستشو شد تا زمانیکه جذب نوری محلول خروجی در طول موج 280 نانومتر به صفر رسید. پس از آن ستون با بافرشستشو (گلایسین-HCl) مجاور شد و خروجی ستون در حجمهای 1 میلی‌لیتر جمع‌آوری گردید و pH آن به‌وسیله تریس 1 مولار تصحیح شده و به pH فیزیولوژیک رسانده شد. جذب نمونه‌ها پس از دیالیز در 280 نانومتر اندازه‌گیری و با استفاده از فرمول بیر-لامبرت) (A=ɛ Cl تعیین غلظت گردید (26, 27).
آماده سازی ژل سفارز CNBr:
ابتدا پپتید CD166 در 50µl محلول DMSO (Sigma) حل شد, محلول به دست آمده به محلول اتصال که بافر 0.1M NaHCO3 (Merck) با PH 8.3 حاوی 0.5M NaCl است اضافه گردید. ژل سفارز فعال شده CNBr با محلول 1mM HCL شست و شو داده شد تا ژل کاملاً متورم و شسته شود. محلول حاوی پپتید در دمای اتاق به مدت 2 ساعت با ژل سفارز فعال مجاور شد. برای مجاور سازی از دستگاه همزن دورانی استفاده گردید. در مرحله بعد, برای بلاک کردن گروه‌های واکنشی باقی مانده, از محلول 0.1M Tris-HCL (Merck) با pH 8 استفاده و حدود 2 ساعت با این محلول مجاور شد. محصول به دست آمده حداقل در 3 چرخه با pH های مختلف و حداقل 5 برابر حجم ژل شست و شو داده شد. هر چرخه شست و شو شامل بافر 0.1M acetate (Merck) با pH 4 حاوی 0.5 MNaCL (Merck) و به دنبال آن بافر 0.1M Tris-HCL با PH 8 حاوی 0.5M NaCl بود (26).
تعیین خلوص آنتیبادیها به روش الکتروفورز SDS-PAGE:
در این روش، جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اختلاف وزن مولکولی صورت می‌گیرد (27, 28). برای این کار ابتدا ژل% 5/12 آکریل آمید آماده شد وسپس 30 میکرولیتر از هر نمونه که با بافر لودینگ حاوی SDS (Merck) و DTT, GE Healthcare)، آمریکا) مخلوط شده بود به همراه مارکر لدر در چاهک‌ها ریختیم. الکتروفورز با ولتاژ 120 ولت تا رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل انجام گرفت. سپس ژل را از دستگاه الکتروفورز جدا کرده و به مدت یک شب در رنگ کوماسی به لو قرار دادیم. دراخر هم توسط آب مقطر رنگ زدایی از ژل انجام شد (26, 27).
یافته‌ها
سنجش غلظت آنتی‌بادی در سرم خرگوش‌های ایمن شده:
بعد از ایمن کردن خرگوش‌ها و تزریق بوستر در فواصل زمانی مشخص و سپس خونگیری و جدا کردن سرم ها, از تست الایزا برای تأیید وجود آنتی‌بادی علیه پپتید CD166 استفاده کردیم. همانگونه که در شکل 1 نشان داده شده است, تزریق در روزهای 0, 14, 28, 49, 83, 200 و 300 انجام شده و خرگوش‌ها طی ایمونیزاسیون های متوالی, علیه پپتید CD166 آنتی‌بادی تولید کرده‌اند. در شکل 2 نیز غلظت آنتی‌بادی خرگوش کنترل (خرگوشی که ایمن نشده) و خرگوش ایمن شده مقایسه شده است. در شکل 3 نیز نتایج تست الایزا پس از تزریق هشتم نشان داده شده است.
شکل (1): نتایج تولید آنتی‌بادی در خرگوش‌های ایمونیزه شده در روزهای مختلف. تزریق در روزهای 0, 14, 28, 49, 83, 200 و 300 انجام شده خرگوش‌ها طی ایمونیزاسیون های متوالی, علیه پپتید 166 CD آنتی‌بادی تولید کرده‌اند. در این آزمایش، تست الایزا با رقت 500/1 از سرم خرگوش‌ها تهیه شده است.
شکل (2): مقایسه‌ی تیتر آنتی‌بادی در خرگوش ایمن شده و خرگوش کنترل
شکل (3): مقایسه‌ی غلظت آنتی‌بادی در خرگوش‌های 1 و 2 بعد از تزریق هشتم
برای خالص کردن آنتی‌بادی‌های خرگوش, از ستون ژل سفارز پروتیین G استفاده کردیم (26). در انتها آنتی‌بادی‌های خرگوش را که به پروتئین G متصل شده بودند، جدا کرده، و در لوله‌های جداگانه جمع‌آوری نمودیم. در این مرحله غلظت IgG ها را اندازه گرفتیم. پس از تخلیص، از خرگوش شماره 2, 7.5 mg/ml آنتی‌بادی و از خرگوش شماره‌ی 1 4 mg/ml آنتی‌بادی به دست آمد. سپس خلوص IgG های خرگوش به‌وسیله‌ی الکتروفورز SDS-PAGE در شرایط احیایی و غیر احیایی تأیید شد (شکل 4).
شکل (4): تأیید خلوص IgG های خرگوش به‌وسیله‌ی الکتروفورز SDS-PAGE. در نوار احیایی 2 باند مشاهده می‌شود که یکی زنجیره‌ی سبک و دیگری زنجیره‌ی سنگین IgG است. زنجیره‌ی سبک به‌واسطه‌ی وزن کمتری که دارد سریعتر به قطب مثبت نزدیک می‌شود در نتیجه پایین‌تر قرار می‌گیرد. با توجه به این که در نوار غیر احیایی, تنها 1 باند تشکیل شده می‌توان نتیجه گرفت که روش خالص‌سازی IgG به روش ژل سفارز پروتئین G موفقیت‌آمیز بوده است.
بررسی اثر pH بر پوشش دهی پپتید 166 CD در کف چاهک‌ها:
با توجه به این که بعداز تزریقات متوالی پپتید CD166 متصل به KLH به خرگوش, پاسخ ایمنی قابل‌توجهی مشاهده نشد و غلظت آن در زمان‌های مختلف عملاً یکسان بود، برای اطمینان از اینکه این نتایج به شرایط آشکار سازی در الایزا مرتبط نیست، تست الایزا را در شرایط مختلف تکرار کردیم. با توجه به اینکه پپتید CD166 کوچک (20 اسید آمینه) بود و هنگام پوشش دهی (coating) در چاهک‌های الایزا این امکان وجود داشت که با توجه به شرایط محیطی, شکل فضایی آن تغییر کند و آنتیبادیها, آنتی‌ژن پپتیدی را به درستی شناسایی نکنند، لازم بود که بهترین شرایط برای پوشش دادن پپتید را بیابیم. به همین دلیل این پپتید در pH های مختلف پوشش داده شد و تأثیر pH بر پوشش دهی پپتید را بررسی کردیم (29). پپتید CD166 را در شش pH مختلف که شامل 4, 6, 7.2, 7.7, 9.7 و 10.4 بود با غلظت یکسان پوشش دادیم. طبق نتایج به دست آمده, تفاوت معناداری در پوشش دهی پپتید CD166 در pH های مختلف مشاهده نشد (شکل 5).
شکل (5): پوشش دهی پپتید CD166 در pH های مختلف. پپتید CD166 در شش pH مختلف که شامل 4, 6, 2/7, 7/7, 7/9 و 4/10 است با غلظت یکسان در کف چاهک‌ها پوشش داده شدند. بقیه‌ی شرایط الایزا برای تمام چاهک‌ها یکسان بوده و نهایتاً واکنش با افزودن HCL متوقف و جذب در 450 نانومتر خوانده شد.
بررسی اثر pH بر واکنش آنتی‌بادی با پپتید پوشش داده شده 166 CD:
یکی دیگر از عوامل تأثیر گذار در الایزا، اتصال آنتی‌بادی به پپتید در pH های مختلف است. در pH اسیدی این امکان وجود دارد که آنتی‌بادی به پپتید متصل نشود (30, 31). در این مرحله، دو تست الایزا برای مقایسه تأثیر اتصال آنتی‌بادی به پپتید در pH 7.2 و 8.5 انجام شد. با توجه به نمودار بالا, آنتی‌بادی در pH 7.2 در مقایسه با pH قلیایی بهتر به پپتید متصل می‌شود. با توجه به شکل 6, آنتی‌بادی در pH 7.2 در مقایسه با pH قلیایی بهتر به پپتید متصل می‌شود. بعد از انجام تست الایزا در شرایط مختلف, تفاوت معناداری برای توجیه نامناسب بودن شرایط آشکار سازی به روش الایزا پیدا نشد. با توجه به پایین بودن تیتر آنتی‌بادی‌های به دست آمده این سؤال برایمان پیش آمد که یا افینتی آنتی‌بادی برای پپتید کم است و یا اینکه این آنتی‌بادی اپیتوپی متشکل از پپتید– KLH را می‌شناسد. برای پاسخ به این سؤال آزمایشات را به‌صورت زیر ادامه دادیم.
شکل (6): مقایسه‌ی اتصال آنتی‌بادی به پپتید CD166 در pH های مختلف
خالص‌سازی آنتی‌بادی ضد پپتید 166 CD با استفاده از ستون سفارز:
بعد از آماده سازی ژل و اتصال پپتید CD166 به ژل سفارز CNBr (26)، سرم خرگوش را چند بار از ستون عبور دادیم و در انتها با اسیدی کردن pH, آنتی‌بادی‌های چسبیده به ژل را جدا کردیم. برای تأیید عملکرد آنتی‌بادی‌های خالص شده, تست الایزا انجام شد. با توجه به این که خرگوش‌ها با پپتید CD166 متصل به KLH ایمن شده بودند, این احتمال وجود دارد که آنتی‌بادی‌های تولید شده, ناحیه‌ی خاصی از کمپلکس پپتید CD166 متصل به KLH را شناسایی کنند. زمانی که CD166 به KLH متصل می‌شود, شکل فضایی آن تغییر می‌کند. آنتی‌بادی‌های تولید شده توسط خرگوش بسته به اینکه ضد کدام ناحیه از این کمپلکس باشد، به نواحی مختلفی متصل می‌شوند. برای نشان دادن این که آنتی‌بادی‌های خالص شده پپتید CD166 را بهتر شناسایی می‌کنند یا پپتید CD166 متصل به KLH، یکبار پپتید CD166 و بار دیگر پپتید CD166 متصل به KLH را در کف چاهک‌ها ریختیم و با روش الایزای غیرمستقیم، واکنش آنتی‌بادی‌های خالص شده را با هر کدام مورد بررسی قرار دادیم. همانگونه که در شکل 7 مشخص است، آنتی‌بادی‌های خالص شده، پپتید CD166 متصل به KLH را بهتر از پپتید CD166 شناسایی می‌کنند.
شکل (7): مقایسه‌ی عملکرد آنتی‌بادی‌های پلی کلونال اختصاص در شناسایی پپتید CD166 و پپتید CD166 متصل به KLH
بحث و نتیجه‌گیری
هدف از انجام این پروژه تولید آنتی‌بادی پلی کلونال اختصاصی علیه بخش خارج سلولی مولکول CD166 بود که در نهایت بتوان با کمک آن سلولهای بیان کننده این مولکول مانند سلولهای مزانشیمی، سلولهای T فعال شده و یا سلولهای توموری را شناسایی و یا مورد هدف قرار داد (1, 2, 5, 9). مزیت آنتی‌بادی پلی کلونال نسبت به آنتی‌بادی مونوکلونال، این است که تولید آن راحتتر و ارزانتر است و می‌توان مقدار زیادی آنتی‌بادی اختصاصی آنتی‌ژن را از مقدار نسبتاً کمی سرم حیوان به دست آورد (20). توالی مورد نظر از پپتید CD166 پرندگان با استفاده از امتیازنامه‌ای که مربوط به ساخت آنتی‌بادی مونوکلونال علیه پپتید CD166 ماکیان در موش بود، انتخاب شد (US2009/0269787A1). علت انتخاب CD166 ماکیان به جای CD166 انسانی شباهت زیاد و تفاوت بسیار کم این مولکول، به‌خصوص بخشی از آن که به لیگاند (CD6) متصل می‌شود، در میان پستانداران بود (3)، بنابراین دست یافتن به آنتی‌بادی علیه این مولکول با تزریق پپتید CD166 انسانی به موش و یا خرگوش بسیار سخت و یا حتی غیرممکن است (رجوع شود به امتیازنامه (US2009/0269787A. این قطعه پپتیدی از آن جهت که مربوط به بخش خارج سلولی مولکول CD166 بود جهت ساخت آنتی‌بادی برای شناسایی و یا هدف قرار دادن سلولهای بیان کننده آن مناسبتر بود. با توجه به این که این پپتید کوچک بود و به‌تنهایی نمی‌توانست سیستم ایمنی خرگوش را به خوبی تحریک کند تحریک کند (32)، با KLH که یک پروتئین بزرگ است کانژوگه گردید (26). اگر چه بعد از تزریقات مکرر پپتید KLH-، خون گیری از خرگوش و انجام تست الایزا, مشخص شد که تیتر آنتی‌بادی افزایش قابل‌توجهی ندارد. با خالص کردن IgG خرگوش ایمن شده و همچنین انجام تست الایزا در PH مختلف نشان داده شد که علت پایین بودن غلظت آنتی‌بادی نچسبیدن پپتید CD166 به کف چاهک‌ها و یا PH نامناسب برای اتصال آنتی‌ژن-آنتی‌بادی، نمی‌باشد. بنابراین پایین بودن غلظت آنتی‌بادی اختصاصی پپتید CD166 علت یا علل دیگری دارد. ازجمله این علت‌ها می‌تواند کوتاه و سنتتیک بودن این پپتید باشد. پپتیدهای سنتتیک کمتر از پروتئین اصلی واکنشهای ایمنی را تحریک می‌کنند زیرا پروتئین دارای چندین اپی توپ بوده و قادر است بهتر سلولهای T کمکی را تحریک و آن‌ها را در پروسه تولید آنتی‌بادی درگیرکند (33). گفته می‌شود پپتیدهای دارای کمتر از 20 اسیدآمینه، ایمنی زایی ضعیفی دارند (33) و پپتید استفاده شده در این مطالعه 20 اسیدآمینه داشت و این مسئله می‌تواند ایمنی زایی آن را کاهش داده باشد. بنابراین ممکن است که استفاده از یک قطعه پروتئینی با طول بزرگتر تولید آنتی‌بادی را بهبود بخشد. برای مثال برای تولید دوآنتی‌بادی پلی کلونال تجاری علیه CD166 انسانی از قطعات پروتئینی با بیش از 100 اسیدآمینه به‌عنوان ایمیونوژن استفاده شده است (https://www.biossusa.com/products/bs-1251r و https://lsbio-7d62.kxcdn.com/antibodies/alcam-antibody-cd166-antibody-aa28-527-hrp-wb-western-ls-c705957/731385). اگرچه این موضوع یک قاعده کلی نیست و قطعات کوچک پپتیدی (حتی کمتر از 20 اسیدآمینه) با موفقیت برای تولید آنتی‌بادی پلی کلونال استفاده شده‌اند. برای مثال نازیلا امینی و همکارانش از یک قطعه با طول 12 اسیدآمینه از پروتئین بتا اکتین، استفاده کرده و علیه آن آنتی‌بادی پلی کلونال تولید کردند (34). در مطالعه دیگری، گودرزی و همکارانش با استفاده از یک پپتید با طول 22 اسیدآمینه از پروتئین روتاویروس گاوی علیه آن، پلی کلونال آنتی‌بادی تولید کردند (35). نشان داده شده است که سکانس اسیدآمینه انتخاب شده نیز می‌تواند بر میزان پاسخ آنتی‌بادی در میزبان تأثیر بگذارد (32).
از طرف دیگر، برای افزایش ایمنی زایی این پپتید، از پروتئین KLH استفاده شد اما این کار خود می‌تواند محدودیتی را ایجاد کند به این صورت که آنتی‌بادی بر علیه این پروتئین و یا بر علیه قسمتی از آن که به پپتید متصل است، تولید شود. همانگونه که نتایج نشان داد، آنتی‌بادی‌های به دست آمده از خرگوش ایمن شده، ترکیب پپتید-KLH را بهتر از پپتید به‌تنهایی شناسایی می‌کردند. این مشاهده می‌تواند به این دلیل باشد که KLH پروتئین بزرگتری نسبت به پپتید مورد استفاده بود و همچنین این احتمال وجود دارد که ناحیه اتصال پپتید به KLH ایمنی زایی بیشتری داشته است. راهکاری که برای تولید آنتی‌بادی پلی کلونال علیه این قطعه از مولکول CD166 وجود دارد آن است که قسمت خارج سلولی این مولکول به‌صورت نوترکیب تولید شده و به خرگوش تزریق شده و سپس از پپتید مورد نظر برای جداسازی آنتی‌بادی در زمان خالص‌سازی استفاده شود که می‌توان در تحقیقات آینده این روش را امتحان نمود. مشابه این روش برای ساخت آنتی‌بادی تجاری علیه قسمت خارج سلولی CD166 موشی در خرگوش استفاده شده است https://www.sinobiological.com/antibodies/mouse-cd166-alcam-50005-rp02). (علت تاکید بر تولید آنتی‌بادی علیه این پپتید خاص آن است که در امتیازنامه نشان داده شده است که این آنتی‌بادی قادر است رشد و تهاجم سلولهای توموری سرطان ریه در موش را کاهش می‌دهد. همچنین آنتی‌بادی به‌طور انتخابی به سلولهای سرطانی ریه در انسان متصل می‌شود (رجوع شود به امتیازنامه (US2009/0269787A. از عوامل دیگری که می‌تواند بر کیفیت و کمیت آنتی‌بادی پلی کلونال تأثیر بگذارد، نوع ادجوانت و پروتئینی است که به‌عنوان حامل استفاده می‌شود (32). بنابراین ممکن است بتوان با استفاده از ادجوانتهای دیگر و همچنین پروتئینهای دیگری مانند آلبومین سرم گاوی به‌عنوان حامل تیتر آنتی‌بادی را افزایش داد. همچنین دوز پپتید تزریقی نیز می‌تواند بر پاسخ هومورال میزبان تأثیر بگذارد (32) بنابراین ممکن است افزایش دوز پپتید تزریقی نیز بتواند به تقویت تولید آنتی‌بادی کمک کند.
نتیجهگیریاز طرف دیگر، برای افزایش ایمنی زایی این پپتید، از پروتئین KLH استفاده شد اما این کار خود می‌تواند محدودیتی را ایجاد کند به این صورت که آنتی‌بادی بر علیه این پروتئین و یا بر علیه قسمتی از آن که به پپتید متصل است، تولید شود. همانگونه که نتایج نشان داد، آنتی‌بادی‌های به دست آمده از خرگوش ایمن شده، ترکیب پپتید-KLH را بهتر از پپتید به‌تنهایی شناسایی می‌کردند. این مشاهده می‌تواند به این دلیل باشد که KLH پروتئین بزرگتری نسبت به پپتید مورد استفاده بود و همچنین این احتمال وجود دارد که ناحیه اتصال پپتید به KLH ایمنی زایی بیشتری داشته است. راهکاری که برای تولید آنتی‌بادی پلی کلونال علیه این قطعه از مولکول CD166 وجود دارد آن است که قسمت خارج سلولی این مولکول به‌صورت نوترکیب تولید شده و به خرگوش تزریق شده و سپس از پپتید مورد نظر برای جداسازی آنتی‌بادی در زمان خالص‌سازی استفاده شود که می‌توان در تحقیقات آینده این روش را امتحان نمود. مشابه این روش برای ساخت آنتی‌بادی تجاری علیه قسمت خارج سلولی CD166 موشی در خرگوش استفاده شده است https://www.sinobiological.com/antibodies/mouse-cd166-alcam-50005-rp02). (علت تاکید بر تولید آنتی‌بادی علیه این پپتید خاص آن است که در امتیازنامه نشان داده شده است که این آنتی‌بادی قادر است رشد و تهاجم سلولهای توموری سرطان ریه در موش را کاهش می‌دهد. همچنین آنتی‌بادی به‌طور انتخابی به سلولهای سرطانی ریه در انسان متصل می‌شود (رجوع شود به امتیازنامه (US2009/0269787A. از عوامل دیگری که می‌تواند بر کیفیت و کمیت آنتی‌بادی پلی کلونال تأثیر بگذارد، نوع ادجوانت و پروتئینی است که به‌عنوان حامل استفاده می‌شود (32). بنابراین ممکن است بتوان با استفاده از ادجوانتهای دیگر و همچنین پروتئینهای دیگری مانند آلبومین سرم گاوی به‌عنوان حامل تیتر آنتی‌بادی را افزایش داد. همچنین دوز پپتید تزریقی نیز می‌تواند بر پاسخ هومورال میزبان تأثیر بگذارد (32) بنابراین ممکن است افزایش دوز پپتید تزریقی نیز بتواند به تقویت تولید آنتی‌بادی کمک کند.
در این مطالعه تلاش شد که علیه قسمتی از بخش خارج سلولی مولکول CD166 آنتی‌بادی پلی کلونال تهیه شود. اگرچه آنتی‌بادی تولیدی تیتر پاِئینی داشته و بخش زیادی از آنتی‌بادی تولید شده علیه قسمت اتصال پپتید به KLH بود. کوچک و سنتتیک بودن پپتید می‌تواند عامل تولید کم آنتی‌بادی علیه آن باشد.
پیشنهادات
استفاده از یک قطعه بزرگتر پپتیدی مانند بخش خارج سلولی مولکول CD166 به‌عنوان ایمیونوژن تزریقی می‌تواند به رفع این مشکل کمک کند. همچنین استفاده از آلبومین گاوی به‌عنوان پروتئین حامل به جای KLH ممکن است سبب بهبود تولید آنتی‌بادی شود.
تعارض منافع: نویسندگان مقاله اظهار می‌دارند که مطالعه حاضر هیچگونه تعارض منافعی ندارد.
تشکر و قدردانی
این طرح تحقیقاتی توسط دانشگاه علوم پزشکی شیراز (شماره گرنت 20195) و مرکز تحقیقات سرطان شیراز (شماره گرنت ICR-100-508) حمایت مالی شده است. لازم به ذکر است که این طرح، به‌عنوان پایان نامه آترین میرشاهی دانشجوی دکترای حرفه‌ای پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شیراز انجام شده است.
نوع مطالعه: پژوهشي(توصیفی- تحلیلی) |
موضوع مقاله:
ایمونولوژی
فهرست منابع
1. Ferragut F, Vachetta VS, Troncoso MF, Rabinovich GA, Elola MT. ALCAM/CD166: A pleiotropic mediator of cell adhesion, stemness and cancer progression. Cytokine Growth Factor Rev 2021;61:27-37. [DOI:10.1016/j.cytogfr.2021.07.001] [PMID]
2. Cardeñes B, Clares I, Bezos T, Toribio V, López-Martín S, Rocha A, et al. ALCAM/CD166 Is Involved in the Binding and Uptake of Cancer-Derived Extracellular Vesicles. Int J Mol Sci 2022;23(10). [DOI:10.3390/ijms23105753] [PMID] [PMCID]
3. Bowen MA, Bajorath J, D'Egidio M, Whitney GS, Palmer D, Kobarg J, et al. Characterization of mouse ALCAM (CD166): the CD6-binding domain is conserved in different homologs and mediates cross-species binding. Eur J Immunol 1997;27(6):1469-78. [DOI:10.1002/eji.1830270625] [PMID]
4. Cortés F, Deschaseaux F, Uchida N, Labastie MC, Friera AM, He D, et al. HCA, an immunoglobulin-like adhesion molecule present on the earliest human hematopoietic precursor cells, is also expressed by stromal cells in blood-forming tissues. Blood 1999a;93(3):826-37.
https://doi.org/10.1182/blood.V93.3.826 [DOI:10.1182/blood.v93.3.826] [PMID]
5. Brinkhof B, Zhang B, Cui Z, Ye H, Wang H. ALCAM (CD166) as a gene expression marker for human mesenchymal stromal cell characterisation. Gene X 2020;5:100031. [DOI:10.1016/j.gene.2020.100031] [PMCID]
6. Weichert W, Knösel T, Bellach J, Dietel M, Kristiansen G. ALCAM/CD166 is overexpressed in colorectal carcinoma and correlates with shortened patient survival. J Clin Path 2004;57(11):1160-64. [DOI:10.1136/jcp.2004.016238] [PMID] [PMCID]
7. Fujiwara K, Ohuchida K, Sada M, Horioka K, Ulrich III CD, Shindo K, et al. CD166/ALCAM expression is characteristic of tumorigenicity and invasive and migratory activities of pancreatic cancer cells. PLoS One 2014;9(9):e107247. [DOI:10.1371/journal.pone.0107247] [PMID] [PMCID]
8. Kim DK, Ham MH, Lee SY, Shin MJ, Kim YE, Song P, et al. CD166 promotes the cancer stem-like properties of primary epithelial ovarian cancer cells. BMB Rep 2020;53(12):622-27.
https://doi.org/10.5483/BMBRep.2020.53.12.102 [DOI:10.5483/bmbrep.2020.53.12.102] [PMID] [PMCID]
9. Kalantari E, Taheri T, Fata S, Abolhasani M, Mehrazma M, Madjd Z, et al. Significant co-expression of putative cancer stem cell markers, EpCAM and CD166, correlates with tumor stage and invasive behavior in colorectal cancer. World J Surg Oncol 2022;20(1):15. [DOI:10.1186/s12957-021-02469-y] [PMID] [PMCID]
10. Tachezy M, Zander H, Wolters-Eisfeld G, Müller J, Wicklein D, Gebauer F, et al. Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166): an "inert" cancer stem cell marker for non-small cell lung cancer? Stem Cells 2014;32(6):1429-36. [DOI:10.1002/stem.1665] [PMID]
11. Jezierska A, Matysiak W, Motyl T. ALCAM/CD166 protects breast cancer cells against apoptosis and autophagy. Med Sci Monit 2006;12(8):BR263-73. [Google Scholar]
12. Donizy P, Zietek M, Halon A, Leskiewicz M, Kozyra C, Matkowski R. Prognostic significance of ALCAM (CD166/MEMD) expression in cutaneous melanoma patients. Diagn Pathol 2015;10:86. [DOI:10.1186/s13000-015-0331-z] [PMID]
13. Ihnen M, Köhler N, Kersten J, Milde-Langosch K, Beck K, Höller S, et al. Expression levels of Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule (ALCAM/CD166) in primary breast carcinoma and distant breast cancer metastases. Dis Markers 2010;28(2):71-8. [DOI:10.1155/2010/812509] [PMID]
14. Swart GW. Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration. Eur J Cell Biol 2002;81(6):313-21. [DOI:10.1078/0171-9335-00256] [PMID]
15. Mezzanzanica D, Fabbi M, Bagnoli M, Staurengo S, Losa M, Balladore E, et al. Subcellular localization of activated leukocyte cell adhesion molecule is a molecular predictor of survival in ovarian carcinoma patients. Clin Cancer Res 2008;14(6):1726-33.
https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-07-0428 [DOI:10.1158/1078-0432.ccr-07-0428] [PMID]
16. Erturk K, Tastekin D, Bilgin E, Serilmez M, Bozbey HU, Sakar B. Serum activated leukocyte cell adhesion molecule and intercellular adhesion molecule-1 in patients with gastric cancer: Can they be used as biomarkers? Biomed Pharmacother 2016;77:86-9. [DOI:10.1016/j.biopha.2015.12.006] [PMID]
17. Kulasingam V, Zheng Y, Soosaipillai A, Leon AE, Gion M, Diamandis EP. Activated leukocyte cell adhesion molecule: a novel biomarker for breast cancer. Int J Cancer 2009;125(1):9-14. [DOI:10.1002/ijc.24292] [PMID] [PMCID]
18. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR J 2005;46(3):258-68. [DOI:10.1093/ilar.46.3.258] [PMID]
19. Demlie T, Balcha E, Fesseha H. Monoclonal Antibody and its Diagnostic Application-Review. Biomed J Sci Techn Res 2020;30(4):23645-51. [DOI:10.26717/BJSTR.2020.30.004997]
20. Stapleton S, O' Kennedy R, Tully E. IMMUNOASSAYS | Production of Antibodies. In: Worsfold P, Townshend A, Poole C, editors. Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition). Oxford: Elsevier; 2005. p. 306-16.
https://doi.org/10.1016/B0-12-369397-7/00263-6 [DOI:10.1016/b0-12-369397-7/00263-6]
21. Ascoli CA, Aggeler B. Overlooked benefits of using polyclonal antibodies. Biotechniques 2018;65(3):127-36. [DOI:10.2144/btn-2018-0065] [PMID]
22. Schunk MK, Macallum GE. Applications and optimization of immunization procedures. ILAR J 2005;46(3):241-57. [DOI:10.1093/ilar.46.3.241] [PMID]
23. Nakazawa M, Mukumoto M, Miyatake K. Production and Purification of Polyclonal Antibodies. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods Protocols 2016:49-59. [DOI:10.1007/978-1-4939-6352-2_3] [PMID]
24. Stills HF. Polyclonal antibody production. The laboratory rabbit, Guinea pig, Hamster, and other rodents: Elsevier; 2012. p. 259-74.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-380920-9.00011-0 [DOI:10.1016/b978-0-12-380920-9.00011-0]
25. Bollen LS, Crowley A, Stodulski G, Hau J. Antibody production in rabbits and chickens immunized with human IgG A comparison of titre and avidity development in rabbit serum, chicken serum and egg yolk using three different adjuvants. J Immunol Methods 1996;191(2):113-20. [DOI:10.1016/0022-1759(96)00010-5] [PMID]
26. Hancock DC, O'Reilly NJ. Production of polyclonal antibodies in rabbits. Methods Mol Biol 2005;295:27-40. [DOI:10.1385/1-59259-873-0:027] [PMID]
27. Nakazawa M, Mukumoto M, Miyatake K. Production and Purification of Polyclonal Antibodies. Methods Mol Biol 2016;1474:49-59. [DOI:10.1007/978-1-4939-6352-2_3] [PMID]
28. Al-Tubuly AA. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med 2000;40:391-405. [DOI:10.1385/1-59259-076-4:391] [PMID]
29. Geerligs HJ, Weijer WJ, Bloemhoff W, Welling GW, Welling-Wester S. The influence of pH and ionic strength on the coating of peptides of herpes simplex virus type 1 in an enzyme-linked immunosorbent assay. J Immunol Methods 1988;106(2):239-44. [DOI:10.1016/0022-1759(88)90203-7] [PMID]
30. Doucet J, Zhao A, Fu J, Avrameas A. Development and validation of an ELISA at acidic pH for the quantitative determination of IL-13 in human plasma and serum. Dis Markers 2013;35(5):465-74. [DOI:10.1155/2013/290670] [PMID] [PMCID]
31. Li Q, Gordon M, Cao C, Ugen KE, Morgan D. Improvement of a low pH antigen-antibody dissociation procedure for ELISA measurement of circulating anti-Abeta antibodies. BMC Neurosci 2007;8:22. [DOI:10.1186/1471-2202-8-22] [PMID] [PMCID]
32. Lee BS, Huang JS, Jayathilaka LP, Lee J, Gupta S. Antibody Production with Synthetic Peptides. Methods Mol Biol 2016;1474:25-47. [DOI:10.1007/978-1-4939-6352-2_2] [PMID]
33. Camacho CJ, Katsumata Y, Ascherman DP. Structural and thermodynamic approach to peptide immunogenicity. PLoS Comput Biol 2008;4(11):e1000231. [DOI:10.1371/journal.pcbi.1000231] [PMID] [PMCID]
34. Amini N, Vishteh MN, Zarei O, Hadavi R, Ahmadvand N, Rabbani H, et al. Production and characterization of polyclonal antibody against a synthetic peptide from β-actin protein. Iran J Basic Med Sci 2014;17(6):396-400. [DOI:10.1016/j.clinbiochem.2011.08.018]
35. Razavi H, Teimoori A, Saberfar E, Soleimanjahi H, Goodarzi Z. Peptide based polyclonal antibody production against bovine rotavirus non structure protein4 (NSP4). Archives of Razi Institute 2015;70(3):157-61. [Google Scholar]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
