دوره 34، شماره 11 - ( 10-1402 )
جلد 34 شماره 11 صفحات 683-675 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rahimi Saatlou H, golestani imani B. EVALUATION OF ANTICANCER EFFECT OF RECOMBINANT AZURIN TOXIN ON BREAST CANCER CELL LINE. Studies in Medical Sciences 2023; 34 (11) :675-683
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-5622-fa.html
URL: http://umj.umsu.ac.ir/article-1-5622-fa.html
رحیمی ساعتلو حسن، گلستانی ایمانی بهرام. بررسی اثر ضدسرطانی توکسین آزورین نوترکیب بر روی رده سلولی سرطان پستان. مجله مطالعات علوم پزشکی. 1402; 34 (11) :675-683
استادیار ژنتیک، گروه زیست شناسی، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران ، golestani_bahram@yahoo.com
متن کامل [PDF 603 kb]
(1108 دریافت)
| چکیده (HTML) (2015 مشاهده)
.png)
.png)
.png)
.png)
.png)
.png)
.png)
.png)
بحث و نتیجه‌گیری
سرطان پستان یکی از شایع‌ترین بیماری‌های بدخیم زنان در سراسر دنیا است که امروزه به یکی از معضلات سازمان‌های بهداشتی تبدیل شده است. سرطان پستان حدود 25 درصد از سرطان‌های زنان را شامل می‌شود. در ایران مانند دیگر کشورهای درحال‌توسعه‌ی آسیا و آفریقا سرطان پستان زنان را حداقل یک دهه جوان‌تر از همتایان خود در کشورهای توسعه‌یافته تحت تأثیر قرار می‌دهد. در درمان سرطان پستان با توجه به شرایط بیمار از روش‌های مختلفی همچون جراحی، شیمی‌درمانی، پرتودرمانی، هورمون درمانی و آنتی‌بادی‌های مونوکلونال استفاده می‌شود. با توجه به عوارض روش‌های درمانی مذکور و میزان تأثیر این روش‌ها بر درمان بیماران و از طرف دیگر هزینه بالای این روش‌ها، نیاز مبرمی به استفاده از فنّاوری‌های نوین برای یافتن روش‌های جدید و پربازده با عوارض جانبی و هزینه کمتر برای درمان احساس می‌شود (18). عدم اثر انتخابی علیه سلول‌های سرطانی یکی از مهم‌ترین ایراد درمان‌های متداول سرطان است. هدف‌گیری انحصاری سلول‌های غیرطبیعی، مرکز تلاش‌های جهانی در زمینه درمان سرطان بوده است (19). در قرن‌های گذشته مشاهداتی در مورد پدیده‌ی برگشت خود به خودی تومورهای مرتبط با عفونت‌های باکتریایی وجود داشته است (20). در اواخر سال 1890 پزشک آمریکایی کولی در مورد یک روند درمانی بر اساس این پدیده گزارش داد (21). ارتباط بین عفونت باکتریایی و برگشت سرطان مشاهده شد. این مشاهدات او را به کشف یک واکسن باکتریایی کشته‌شده برای سرطان، معروف به توکسین کولی رساند (20). سرانجام به توسعه‌ی روش‌های درمانی جدید ضد سرطان بر اساس استفاده از باکتری‌های زنده و محصولات تولیدشده به‌وسیله‌ی آن‌ها ازجمله سموم باکتریایی، پروتئین‌ها، پپتیدها و آنزیم‌ها جهت داد. اخیراً، تعدادی از پروتئین‌ها و پپتیدهای باکتریایی توصیف شده است که فعالیت ضد سرطانی را در سطح پیش بالینی نسبت به انواع مختلف سلول‌های سرطانی نشان می‌دهند (22). اکتریوسین‌ها نشان داده‌اند که می‌توانند یک عامل درمانی فعال باشند و خواص بیوشیمیایی آن‌ها موردمطالعه قرار گرفته است. سودوموناس آئروژینوزا یک باکتری بیماری‌زای گرم منفی دارای توانایی تولید پروتئین آزورین ضد سرطانی است. پروتئین آزورین می‌تواند به‌عنوان سلاحی برای حمله به سرطان‌ها، انگل‌ها و ویروس‌ها مورداستفاده قرار گیرد (23). سمیت سلولی آزورین فقط برای سلول‌های سرطانی است و بر سلول‌های سالم تأثیر نمی‌گذارد و عوارض جانبی سمی کمتری دارد. تعداد فوق‌العاده‌ای از مواد درمانی می‌توانند به مولکول آزورین متصل شوند و آن به دلیل توانایی عمل به‌عنوان پروتئین حامل است (24). داروهای شیمی‌درمانی امروزی که برای درمان سرطان استفاده می‌شوند اغلب سمی هستند و مستعد ایجاد مقاومت توسط سلول‌های سرطانی هستند که درنهایت منجر به تومورهای مقاوم به دارو می‌شوند. توانایی آزورین در تداخل یا برگشت رشد تومور در نقاط مختلف حمله ممکن است در پیشگیری از پیشرفت مقاومت مؤثر باشد. از ویژگی چنین پروتئینی می‌توان به‌عنوان سلاحی برای افزایش طیف وسیعی از روش‌ها مانند فعالیت ضد سرطانی و ضد انگلی استفاده کرد. آزورین می‌تواند از القای تشکیل ضایعات پیش سرطانی جلوگیری کند. یک ماده سرطان‌زا می‌تواند باعث ایجاد ضایعه‌ی پیش سرطانی شود (25). آزورین وارد سلول‌های سرطانی پستان می‌شود و باعث مرگ سلولی آپوپتوتیک می‌شود. مرگ سلول‌های سرطانی با تشکیل کمپلکس با پروتئین شناخته‌شده‌ی p53 سرکوب‌کننده‌ی تومور صورت می‌گیرد. فرم پایدار پروتئین p53 همراه با فعال‌سازی کاسپازها باعث آپوپتوز در سلول‌های سرطانی می‌شود (26). یافته‌های ما حکایت از سمیت آزورین در هر دو رده‌ی سلولی MCF7 و HEK293 دارد ولی سمیت آزورین روی رده سلولی MCF7 بیشتر است، به‌طوری‌که آزورین در کمترین غلظت دارای 4درصد اثر سیتوتوکسیک روی رده سلولی MCF7 است و این حاکی از اثر انتخابی آزورین روی سلول‌های سرطانی است. گزارشات مختلفی از توان ضد سرطانی آزورین در مطالعات قبلی ارائه شده است. نفیسه پایدارنیا و همکاران اثر سمیت سینرژیسمی پروتئین هم جوش گرانزیم –B آزورین روی سلول‌های سرطانی پستان را اثبات کردند و اثر سیتوتوکسیک قابل‌توجه در سلول‌های MCF7 و MDA-MB-231 و SK-BR-3 مشاهده کردند درحالی‌که اثر سیتوتوکسیک قابل‌توجهی در سلول‌های طبیعی MCF10A مشاهده نکردند. Paydarnia و همکاران (2019) و Mohamed MS و همکاران (2010) اثر آزورین را به‌عنوان پروتئین ضد تومور در رده‌های سلولی سرطان نشان دادند و آزورین به‌شدت از تکثیر رده سلولی سرطان روده بزرگ HCT116 و رده سلولی سرطان پستان MCF7 جلوگیری کرد و آزورین هیچ تأثیری بر ملانوسیت‌های طبیعی HFB4 نشان نداد. Kim UK و همکاران اثر آزورین نوترکیب را در سلول‌های سرطان سنگفرش دهان اثبات نمودند و آزورین اثر سیتوتوکسیک وابسته به دوز در سلول‌های YD-9 نشان داد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که آزورین می‌تواند تا حدودی علیه سلول سرطانی گزینشی عمل کند و اثر ضدسرطانی بالقوه‌ای روی رده سلولی MCF7 داشته باشد.
تشکر و قدردانی:
از تمامی کسانی که ما را در این مطالعه یاری فرمودند تشکر و قدردانی می‌کنیم.
حمایت مالی:
ندارد.
تضاد منافع:
نویسندگان در این مطالعه هیچ تضاد منافعی نداشتند.
ملاحظات اخلاقی:
این مطالعه با در نظر گرفتن ملاحظات اخلاقی برای انجام امور پژوهشی اقدام شده است.
متن کامل: (740 مشاهده)
مقدمه
آزورین یک پروتئین با وزن مولکولی کم، آبی، حاوی مس است که به‌طور طبیعی در سودوموناس آئروژینوزا تولید می‌شود (1). طول ژن کد کننده‌ی آزورین bp1287 جفت باز است که یک پروتئین 14 کیلو دالتون حاوی 128 اسیدآمینه را کد می‌کند (2). آزورین در دهه‌ی گذشته به دلیل سمیت سلولی نسبت به انواع سلول‌های سرطانی توجه زیادی به خود جلب کرده است (3، 4). آزورین دارای خاصیت سایتوتوکسیک است و می‌تواند به‌طور خاص به سلول‌های سرطانی انسان نفوذ کند، به‌ویژه سرطان پستان و باعث آپوپتوز شود و در سلول‌های طبیعی فعالیت آشکاری نداشته باشد (5، 6). آزورین یک پروتئین همه‌کاره است و در چندین مسیر سیگنال‌دهی مستقل مرتبط با پیشرفت سرطان دخالت می‌کند. تاکنون، چندین مکانیسم مختلف برای فعالیت ضد سرطانی آزورین ارائه شده است (7). سرطان پستان شایع‌ترین سرطان در زنان بوده به‌طوری‌که طبق گزارش GLOBOCAN، تقریباً 1.38 میلیون سرطان جدید پستان در سال 2008 و 1.67 میلیون مورد در 2012 تشخیص داده شده است (8). سالانه بیش از 8500 مورد جدید از این بیماری در کشور ایران تشخیص داده می‌شود که بقای عمر 5 ساله‌ی بیماران حدود 60 الی 80 درصد گزارش شده است (9). درمان‌های کنونی سرطان و البته در مورد سرطان پستان، متکی به جراحی، شیمی‌درمانی و پرتودرمانی یا حتی هورمون درمانی است. بااین‌حال، این درمان‌ها می‌توانند عوارض جانبی جدی و سیستمیک را در سلامت بیمار به دلیل سمیت بالا و عدم اختصاصیت بافت سرطانی ایجاد کنند (10). سرطان پستان شامل گروهی از بیماری‌های ناهمگن بیولوژیکی و مولکولی منشأ گرفته از پستان است، درحالی‌که عوامل مؤثر در بروز این سرطان با توجه به سایر سرطان‌ها متفاوت است، تمایل و استعداد ژنتیکی که مهم‌ترین آن‌ها جهش در ژن BRCA1 و BRCA2 است، یکی از عوامل مهم برای بروز این بدخیمی است (11).
به نظر می‌رسد که سرطان پستان ممکن است از سلول‌های بنیادی پستانداران ناشی شود. رشد طبیعی پستان و سلول‌های بنیادی توسط چندین مسیر سیگنال‌دهی نظیر گیرنده‌های ERs Estrogen)) و HER2 و Wnt/b-catenin تنظیم می‌شود که تکثیر سلول‌های بنیادی، مرگ سلولی، تمایز سلولی و تحرک سلولی را کنترل می‌کند. علاوه بر این، تنظیم‌اپی ژنتیکی و RNAهای غیرکدکننده نقش مهمی در پیشرفت سرطان دارند (11). آزورین با 4 مکانیسم اثر ضد سرطانی خود را روی مولکول‌های هدف ایجاد می‌کند:
1) p53: آزورین در رشد سلول توسط مکانیسم‌های مختلف ازجمله تشکیل کمپلکس با دامنه اتصال به (DBD) DNA پروتئین سرکوبگر تومور p53 دخالت می‌کند، آن را تثبیت می‌کند و سطح داخل سلولی آن را تقویت می‌کند که پس‌ازآن باعث القاء آپوپتوز می‌شود.
2) تیروزین کینازهای غیر رسپتوری (FAK و Src): تهاجم‌های سرطانی را کاهش می‌دهند. بخصوص، هایپرفسفوریلاسیون تیروزین کیناز غیر رسپتوری مرتبط با بیان بیش‌ازحد P-کادهرین را کاهش می‌دهند.
3) گیرنده‌های تیروزین کیناز EphB2: آزورین فسفوریلاسیون به‌واسطه‌ی ephrinB2 در تیروزین ephB2 را مهار می‌کند. درنتیجه در سیگنال‌دهی سلول بالادست دخالت کرده و به مهار رشد سلول‌های سرطانی کمک می‌کند.
4) رسپتورهای کموکین و رسپتور تیروزین کیناز (EGFR): بیان گیرنده‌های غشایی درگیر در سیگنال‌دهی سلول را محدود می‌کنند. همچنین آزورین اثرات ضد سرطانی خودش را به‌واسطه‌ی مسیر ورود به سلول سرطانی، با مختل سازی گیرنده‌ی حفره غشایی و حذف گیرنده‌های انتخابی غشای سلولی که ممکن است بیش‌فعال شود اعمال می‌کند. بنابراین از فعال شدن دائمی و درنتیجه تومور جلوگیری می‌شود (12-15).
هدف از این مطالعه بررسی اثر ضد سرطانی آزورین در رده سلولی سرطان پستان MCF7 و رده سلولی طبیعی HEK293 بود.
مواد و روش کار
کلونینگ ژن آزورین در باکتری اشرشیا کلی TOP10:
سازه ژنی بهینه‌شده متصل به حامل پلاسمیدی pET28a به‌صورت آماده تهیه گردید و برای کلونینگ و بیان به ترتیب از باکتری‌های E.coli TOP10 و E.coliBL21(DE3) به‌عنوان میزبان استفاده شد. برای این منظور از پرایمرهای T7TerminAtor 5’GCTAGTTATTGCTCAGCGG3’) و (T7promoTer 5’TAATACGACTCACTATAGGG3’ برای تأیید ژن آزورین استفاده گردید. اجزای واکنش PCR شامل 5/2 میکرولیتر بافر PCR، 5/0 میلی مولار dNTPs، 1 میلی مولار MgCL2، 5/0 میلی مولار از هرکدام از پرایمرها، 01/0 میکروگرم بر میکرولیتر DNA الگو، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taq پلی‌مراز و 5/18 میکرولیتر آب استریل دیونیزه بود. واکنش با برنامه دمایی 95 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه، 35 دوره شامل 94 درجه سلسیوس (20 ثانیه)، 56 درجه سلسیوس (20 ثانیه) و 72 درجه سلسیوس (20 ثانیه) و درنهایت یک مرحله 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. مستعد سازی TOP10 برای ساب کلونینگ و BL21 برای بیان با استفاده از بافر کلرید کلسیم انجام گردید. پس از ترانسفورماسیون توسط شوک گرما-سرما باکتری‌ها در محیط کشت LB حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین کشت داده شد و کلنی‌ها به‌منظور انجام PCR Colony انتخاب گردید. PCR با شرایط دمایی و مخلوط واکنش اشاره‌شده در بالا انجام شد و محصول Colony PCR روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز گردید.
ساب کلونینگ و بیان ژن آزورین در باکتری اشرشیا کلی BL21:
از کلنی‌های حاوی حامل نوترکیب، پلاسمیدها به روش لیز قلیایی استخراج شد و وارد E.coli BL21 مستعد شده گردید. برای القای بیان از ایزوپروپیل بتادی تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) 1 میلی مولار استفاده شد. پس از القای بیان در زمان‌های 2، 4 و 24 ساعت نمونه‌برداری گردید و نمونه‌ها با افزوده شدن سمپل بافر و جوشانیدن به مدت 5 دقیقه روی ژل SDS PAGE 12درصد الکتروفورز شد (16).
بیان پروتئین نوترکیب آزورین در مقیاس بالا:
ابتدا به درون فالکون حاوی 5 میلی‌لیتر محیط کشت LB و 5 میکرولیتر آنتی‌بیوتیک کانامایسین کلنی تأییدشده در SDS PAGE اضافه گردید و بعد از 24 ساعت به درون ارلن حاوی 50 سی‌سی محیط کشت LB و 5 میکرولیتر آنتی‌بیوتیک کانامایسین
تلقیح شد و با رسیدن OD به 6/0-8/0 با IPTG 1 میلی مولار القا گردید و پس از 4 ساعت محتویات ارلن به داخل فالکون ریخته شد و بعد از سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه با 3500 rpm محلول رویی حذف گردید و رسوب باکتری‌ها جهت استخراج پروتئین در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. برای تخلیص پروتئین نوترکیب رسوب باکتریایی به روش Native و Denature شکافته شد و از کروماتوگرافی ترکیبی ستون نیکل استفاده گردید. بعد از انجام تخلیص برای تأیید تولید پروتئین نوترکیب آزورین وسترن بلات با آنتی‌بادی Anti His-Tag انجام شد (16).
کشت سلولی:
رده سلولی سرطان پستان MCF-7 و رده سلولی طبیعی (سلول‌های جنینی کلیه) HEK293 تهیه شد و از محـیط کشت DMEM با 10 درصد سرم جنـین گـاوی (FBS)، سدیم پیرووات 100 میلی مولار،g/l 5/1 سدیم بیکربنات و 1 درصد آنتی‌بیوتیک پنیسـیلین- استرپتومایسـین استفاده گردید و در انکوبــاتور (USA, BINDER) در دمــای 37 درجــه سانتی‌گراد و رطوبت کافی و میزان 5 درصد دی‌اکسید کربن انکوبه گردید (17).
MTT assay:
از سلول‌هایی که به روش بالا کشت گردید به مقدار 100000 سلول (50 ماکرولیتر) به‌طور مساوی داخل ردیف‌های پلیت 96 خانه ریخته شد و رقت‌های 1، 2، 3، 6، 13، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از پروتئین به چاهک‌های حاوی سلول افزوده شد سپس 24 ساعت داخل انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت اشباع و میزان 5 درصد دی‌اکسید کربن انکوبه گردید. از محیط RPMI به‌عنوان کنترل منفی استفاده شد. پس از انکوباسیون به میزان 10 میکرولیتر از محلول MTT به هر چاهک اضافه گردید سپس 2 ساعت داخل انکوباتور با شرایط بالا قرار گرفت و محیط رویی سلول‌ها خالی شد سپس محلول دی متیل سولفوکساید (DMSO) به میزان 100 ماکرولیتر به هر چاهک اضافه گردید و بعد از 10 دقیقه میزان جذب OD در طول‌موج 570 نانومتر خوانده شد و برای آنالیز آماری از آزمون Mann-Whitney استفاده گردید.
یافته‌ها
تأیید پلاسمید‌های PET28a موجود در باکتری E.coli BL21(DE3):
پس از استخراج پلاسمیدها از باکتری‌های E.coli BL21 DE3 با استفاده از کیت شرکت (GeNet Bio)، محصولات حاصله بر روی ژل آگارز 1درصد بررسی و وجود پلاسمیدها در باکتری مورد تأیید قرار گرفت که در شکل 1 سه باند موردنظر قابل‌مشاهده است.
آزورین یک پروتئین با وزن مولکولی کم، آبی، حاوی مس است که به‌طور طبیعی در سودوموناس آئروژینوزا تولید می‌شود (1). طول ژن کد کننده‌ی آزورین bp1287 جفت باز است که یک پروتئین 14 کیلو دالتون حاوی 128 اسیدآمینه را کد می‌کند (2). آزورین در دهه‌ی گذشته به دلیل سمیت سلولی نسبت به انواع سلول‌های سرطانی توجه زیادی به خود جلب کرده است (3، 4). آزورین دارای خاصیت سایتوتوکسیک است و می‌تواند به‌طور خاص به سلول‌های سرطانی انسان نفوذ کند، به‌ویژه سرطان پستان و باعث آپوپتوز شود و در سلول‌های طبیعی فعالیت آشکاری نداشته باشد (5، 6). آزورین یک پروتئین همه‌کاره است و در چندین مسیر سیگنال‌دهی مستقل مرتبط با پیشرفت سرطان دخالت می‌کند. تاکنون، چندین مکانیسم مختلف برای فعالیت ضد سرطانی آزورین ارائه شده است (7). سرطان پستان شایع‌ترین سرطان در زنان بوده به‌طوری‌که طبق گزارش GLOBOCAN، تقریباً 1.38 میلیون سرطان جدید پستان در سال 2008 و 1.67 میلیون مورد در 2012 تشخیص داده شده است (8). سالانه بیش از 8500 مورد جدید از این بیماری در کشور ایران تشخیص داده می‌شود که بقای عمر 5 ساله‌ی بیماران حدود 60 الی 80 درصد گزارش شده است (9). درمان‌های کنونی سرطان و البته در مورد سرطان پستان، متکی به جراحی، شیمی‌درمانی و پرتودرمانی یا حتی هورمون درمانی است. بااین‌حال، این درمان‌ها می‌توانند عوارض جانبی جدی و سیستمیک را در سلامت بیمار به دلیل سمیت بالا و عدم اختصاصیت بافت سرطانی ایجاد کنند (10). سرطان پستان شامل گروهی از بیماری‌های ناهمگن بیولوژیکی و مولکولی منشأ گرفته از پستان است، درحالی‌که عوامل مؤثر در بروز این سرطان با توجه به سایر سرطان‌ها متفاوت است، تمایل و استعداد ژنتیکی که مهم‌ترین آن‌ها جهش در ژن BRCA1 و BRCA2 است، یکی از عوامل مهم برای بروز این بدخیمی است (11).
به نظر می‌رسد که سرطان پستان ممکن است از سلول‌های بنیادی پستانداران ناشی شود. رشد طبیعی پستان و سلول‌های بنیادی توسط چندین مسیر سیگنال‌دهی نظیر گیرنده‌های ERs Estrogen)) و HER2 و Wnt/b-catenin تنظیم می‌شود که تکثیر سلول‌های بنیادی، مرگ سلولی، تمایز سلولی و تحرک سلولی را کنترل می‌کند. علاوه بر این، تنظیم‌اپی ژنتیکی و RNAهای غیرکدکننده نقش مهمی در پیشرفت سرطان دارند (11). آزورین با 4 مکانیسم اثر ضد سرطانی خود را روی مولکول‌های هدف ایجاد می‌کند:
1) p53: آزورین در رشد سلول توسط مکانیسم‌های مختلف ازجمله تشکیل کمپلکس با دامنه اتصال به (DBD) DNA پروتئین سرکوبگر تومور p53 دخالت می‌کند، آن را تثبیت می‌کند و سطح داخل سلولی آن را تقویت می‌کند که پس‌ازآن باعث القاء آپوپتوز می‌شود.
2) تیروزین کینازهای غیر رسپتوری (FAK و Src): تهاجم‌های سرطانی را کاهش می‌دهند. بخصوص، هایپرفسفوریلاسیون تیروزین کیناز غیر رسپتوری مرتبط با بیان بیش‌ازحد P-کادهرین را کاهش می‌دهند.
3) گیرنده‌های تیروزین کیناز EphB2: آزورین فسفوریلاسیون به‌واسطه‌ی ephrinB2 در تیروزین ephB2 را مهار می‌کند. درنتیجه در سیگنال‌دهی سلول بالادست دخالت کرده و به مهار رشد سلول‌های سرطانی کمک می‌کند.
4) رسپتورهای کموکین و رسپتور تیروزین کیناز (EGFR): بیان گیرنده‌های غشایی درگیر در سیگنال‌دهی سلول را محدود می‌کنند. همچنین آزورین اثرات ضد سرطانی خودش را به‌واسطه‌ی مسیر ورود به سلول سرطانی، با مختل سازی گیرنده‌ی حفره غشایی و حذف گیرنده‌های انتخابی غشای سلولی که ممکن است بیش‌فعال شود اعمال می‌کند. بنابراین از فعال شدن دائمی و درنتیجه تومور جلوگیری می‌شود (12-15).
هدف از این مطالعه بررسی اثر ضد سرطانی آزورین در رده سلولی سرطان پستان MCF7 و رده سلولی طبیعی HEK293 بود.
مواد و روش کار
کلونینگ ژن آزورین در باکتری اشرشیا کلی TOP10:
سازه ژنی بهینه‌شده متصل به حامل پلاسمیدی pET28a به‌صورت آماده تهیه گردید و برای کلونینگ و بیان به ترتیب از باکتری‌های E.coli TOP10 و E.coliBL21(DE3) به‌عنوان میزبان استفاده شد. برای این منظور از پرایمرهای T7TerminAtor 5’GCTAGTTATTGCTCAGCGG3’) و (T7promoTer 5’TAATACGACTCACTATAGGG3’ برای تأیید ژن آزورین استفاده گردید. اجزای واکنش PCR شامل 5/2 میکرولیتر بافر PCR، 5/0 میلی مولار dNTPs، 1 میلی مولار MgCL2، 5/0 میلی مولار از هرکدام از پرایمرها، 01/0 میکروگرم بر میکرولیتر DNA الگو، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taq پلی‌مراز و 5/18 میکرولیتر آب استریل دیونیزه بود. واکنش با برنامه دمایی 95 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه، 35 دوره شامل 94 درجه سلسیوس (20 ثانیه)، 56 درجه سلسیوس (20 ثانیه) و 72 درجه سلسیوس (20 ثانیه) و درنهایت یک مرحله 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. مستعد سازی TOP10 برای ساب کلونینگ و BL21 برای بیان با استفاده از بافر کلرید کلسیم انجام گردید. پس از ترانسفورماسیون توسط شوک گرما-سرما باکتری‌ها در محیط کشت LB حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین کشت داده شد و کلنی‌ها به‌منظور انجام PCR Colony انتخاب گردید. PCR با شرایط دمایی و مخلوط واکنش اشاره‌شده در بالا انجام شد و محصول Colony PCR روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز گردید.
ساب کلونینگ و بیان ژن آزورین در باکتری اشرشیا کلی BL21:
از کلنی‌های حاوی حامل نوترکیب، پلاسمیدها به روش لیز قلیایی استخراج شد و وارد E.coli BL21 مستعد شده گردید. برای القای بیان از ایزوپروپیل بتادی تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) 1 میلی مولار استفاده شد. پس از القای بیان در زمان‌های 2، 4 و 24 ساعت نمونه‌برداری گردید و نمونه‌ها با افزوده شدن سمپل بافر و جوشانیدن به مدت 5 دقیقه روی ژل SDS PAGE 12درصد الکتروفورز شد (16).
بیان پروتئین نوترکیب آزورین در مقیاس بالا:
ابتدا به درون فالکون حاوی 5 میلی‌لیتر محیط کشت LB و 5 میکرولیتر آنتی‌بیوتیک کانامایسین کلنی تأییدشده در SDS PAGE اضافه گردید و بعد از 24 ساعت به درون ارلن حاوی 50 سی‌سی محیط کشت LB و 5 میکرولیتر آنتی‌بیوتیک کانامایسین
تلقیح شد و با رسیدن OD به 6/0-8/0 با IPTG 1 میلی مولار القا گردید و پس از 4 ساعت محتویات ارلن به داخل فالکون ریخته شد و بعد از سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه با 3500 rpm محلول رویی حذف گردید و رسوب باکتری‌ها جهت استخراج پروتئین در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. برای تخلیص پروتئین نوترکیب رسوب باکتریایی به روش Native و Denature شکافته شد و از کروماتوگرافی ترکیبی ستون نیکل استفاده گردید. بعد از انجام تخلیص برای تأیید تولید پروتئین نوترکیب آزورین وسترن بلات با آنتی‌بادی Anti His-Tag انجام شد (16).
کشت سلولی:
رده سلولی سرطان پستان MCF-7 و رده سلولی طبیعی (سلول‌های جنینی کلیه) HEK293 تهیه شد و از محـیط کشت DMEM با 10 درصد سرم جنـین گـاوی (FBS)، سدیم پیرووات 100 میلی مولار،g/l 5/1 سدیم بیکربنات و 1 درصد آنتی‌بیوتیک پنیسـیلین- استرپتومایسـین استفاده گردید و در انکوبــاتور (USA, BINDER) در دمــای 37 درجــه سانتی‌گراد و رطوبت کافی و میزان 5 درصد دی‌اکسید کربن انکوبه گردید (17).
MTT assay:
از سلول‌هایی که به روش بالا کشت گردید به مقدار 100000 سلول (50 ماکرولیتر) به‌طور مساوی داخل ردیف‌های پلیت 96 خانه ریخته شد و رقت‌های 1، 2، 3، 6، 13، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از پروتئین به چاهک‌های حاوی سلول افزوده شد سپس 24 ساعت داخل انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت اشباع و میزان 5 درصد دی‌اکسید کربن انکوبه گردید. از محیط RPMI به‌عنوان کنترل منفی استفاده شد. پس از انکوباسیون به میزان 10 میکرولیتر از محلول MTT به هر چاهک اضافه گردید سپس 2 ساعت داخل انکوباتور با شرایط بالا قرار گرفت و محیط رویی سلول‌ها خالی شد سپس محلول دی متیل سولفوکساید (DMSO) به میزان 100 ماکرولیتر به هر چاهک اضافه گردید و بعد از 10 دقیقه میزان جذب OD در طول‌موج 570 نانومتر خوانده شد و برای آنالیز آماری از آزمون Mann-Whitney استفاده گردید.
یافته‌ها
تأیید پلاسمید‌های PET28a موجود در باکتری E.coli BL21(DE3):
پس از استخراج پلاسمیدها از باکتری‌های E.coli BL21 DE3 با استفاده از کیت شرکت (GeNet Bio)، محصولات حاصله بر روی ژل آگارز 1درصد بررسی و وجود پلاسمیدها در باکتری مورد تأیید قرار گرفت که در شکل 1 سه باند موردنظر قابل‌مشاهده است.
شکل (1): تصویر ژل الکتروفورز پلاسمید PET28a تخلیص شده
ستون M: DNA نشانگر 1 kb، ستون 1: پلاسمید PET28a تخلیص شده
تأیید انتقال pET28a-Azurin به میزبان کلونینگ TOP10:
پس از انتقال وکتور نوترکیب pET28a-Azurin به سلول مستعد TOP10، روی محیط کشت LB آگار حاوی کانامایسین (غلظت 50 میکرولیتر) کشت داده شد سپس برای کلونی‌های TOP10 تراریخت شده‌ی حاوی pET28a، واکنش Colony PCR انجام شد و باندهای مورد انتظار در محدوده‌ی 600 جفت بازی مشاهده گردید (شکل 2).
ستون M: DNA نشانگر 1 kb، ستون 1: پلاسمید PET28a تخلیص شده
تأیید انتقال pET28a-Azurin به میزبان کلونینگ TOP10:
پس از انتقال وکتور نوترکیب pET28a-Azurin به سلول مستعد TOP10، روی محیط کشت LB آگار حاوی کانامایسین (غلظت 50 میکرولیتر) کشت داده شد سپس برای کلونی‌های TOP10 تراریخت شده‌ی حاوی pET28a، واکنش Colony PCR انجام شد و باندهای مورد انتظار در محدوده‌ی 600 جفت بازی مشاهده گردید (شکل 2).
شکل (2): انتقال PET28a-Azurin به میزبان کلونینگ TOP10
1-کنترل منفی نمونه فاقد الگو
2-کنترل مثبت pET28a حاوی یک ژن 700 جفت بازی
3 تا 7- کلونی‌های مختلف حاصل از ترانسفورم سویه TOP10 با پلاسمید حاوی pET28a-Azurin
8- نشانگر وزن مولکولی DNA(1 kb)
تأیید انتقال pET28a-Azurin به میزبان بیانی BL21(DE3):
برای بیان پروتئین آزورین در باکتری، سازه pET28a-Azurin به درون سلول مستعد شده‌ی BL21(DE3) ترانسفورم شد و روی کلنی‌های تراریختی coliBL21(DE3).E حاوی pET28a-Azurin، Colony PCR انجام گردید. محصول واکنش بر روی ژل آگارز 1درصد الکتروفوزر شد و باندهای مورد انتظار در محدوده‌ی 600 جفت بازی مشاهده گردید (شکل 3).
1-کنترل منفی نمونه فاقد الگو
2-کنترل مثبت pET28a حاوی یک ژن 700 جفت بازی
3 تا 7- کلونی‌های مختلف حاصل از ترانسفورم سویه TOP10 با پلاسمید حاوی pET28a-Azurin
8- نشانگر وزن مولکولی DNA(1 kb)
تأیید انتقال pET28a-Azurin به میزبان بیانی BL21(DE3):
برای بیان پروتئین آزورین در باکتری، سازه pET28a-Azurin به درون سلول مستعد شده‌ی BL21(DE3) ترانسفورم شد و روی کلنی‌های تراریختی coliBL21(DE3).E حاوی pET28a-Azurin، Colony PCR انجام گردید. محصول واکنش بر روی ژل آگارز 1درصد الکتروفوزر شد و باندهای مورد انتظار در محدوده‌ی 600 جفت بازی مشاهده گردید (شکل 3).
شکل (3): انتقال PET28a-Azurin به میزبان بیانی BL21(DE3)
1 تا 9-کلونی‌های مختلف حاصل از ترانسفورم سویه Bl21(DE3) با پلاسمید حاوی pET28a-Azurin
10- کنترل مثبت pET28a حاوی یک ژن 700 جفت بازی
11- کنترل منفی نمونه فاقد الگو
12- نشانگر وزن مولکولی DNA
غربالگری کلنی‌ها برای تأیید بیان پروتئین آزورین:
انجام فن SDS PAGE نشان داد که پروتئین نوترکیب 2/19 کیلو دالتونی آزورین در کلنی‌های منتخب بیان شده است که در شکل 4 قابل‌مشاهده است.
1 تا 9-کلونی‌های مختلف حاصل از ترانسفورم سویه Bl21(DE3) با پلاسمید حاوی pET28a-Azurin
10- کنترل مثبت pET28a حاوی یک ژن 700 جفت بازی
11- کنترل منفی نمونه فاقد الگو
12- نشانگر وزن مولکولی DNA
غربالگری کلنی‌ها برای تأیید بیان پروتئین آزورین:
انجام فن SDS PAGE نشان داد که پروتئین نوترکیب 2/19 کیلو دالتونی آزورین در کلنی‌های منتخب بیان شده است که در شکل 4 قابل‌مشاهده است.
شکل (4): کنترل بیان
1- نمونه باکتری قبل از القا با IPTG
2- نشانگر وزن مولکولی پروتئین
3 تا 5 نمونه بیان کلونی، شماره 1 و 6 تا 8 نمونه بیان کلونی شماره 2 به ترتیب در فواصل زمانی 2،4 و 24 ساعت پس از القا با IPTG یک میلی مولار
تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی ترکیبی نیکل (Ni-NTS):
تخلیص پروتئین نوترکیب نشان‌دار شده با His-tag به‌وسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA انجام شد. شکل 5 تخلیص پروتئین نوترکیب آزورین در شرایط Native و شکل 6 تخلیص پروتئین نوترکیب آزورین را در شرایط Denature نشان می‌دهد. همان‌طور که در شکل 6 مشاهده می‌شود بیشتر پروتئین‌های نوترکیب موردنظر ما در فاز نامحلول (Denature) تخلیص شدند.
1- نمونه باکتری قبل از القا با IPTG
2- نشانگر وزن مولکولی پروتئین
3 تا 5 نمونه بیان کلونی، شماره 1 و 6 تا 8 نمونه بیان کلونی شماره 2 به ترتیب در فواصل زمانی 2،4 و 24 ساعت پس از القا با IPTG یک میلی مولار
تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی ترکیبی نیکل (Ni-NTS):
تخلیص پروتئین نوترکیب نشان‌دار شده با His-tag به‌وسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA انجام شد. شکل 5 تخلیص پروتئین نوترکیب آزورین در شرایط Native و شکل 6 تخلیص پروتئین نوترکیب آزورین را در شرایط Denature نشان می‌دهد. همان‌طور که در شکل 6 مشاهده می‌شود بیشتر پروتئین‌های نوترکیب موردنظر ما در فاز نامحلول (Denature) تخلیص شدند.
شکل (5): تخلیص پروتئین آزورین در شرایط محلول (Native) روی ژل SDS-PAGE12درصد
چاهک 1-نشانگر پروتئین، چاهک 2- خروجی ستون پس از بارگذاری پروتئین، چاهک 3- شست‌وشو توسط بافر، چاهک 4 الی 8:Elutions
چاهک 1-نشانگر پروتئین، چاهک 2- خروجی ستون پس از بارگذاری پروتئین، چاهک 3- شست‌وشو توسط بافر، چاهک 4 الی 8:Elutions
شکل (6): تخلیص پروتئین آزورین در شرایط نامحلول (Denature) روی ژل SDS-PAGE12درصد
چاهک 1- خروجی ستون پس از بارگذاری پروتئین، چاهک 2- شست‌وشو توسط بافر حاوی اوره 8 مولار، چاهک 3- نشانگر پروتئین، چاهک 4 الی 8-Elutions
تأیید محصولات پروتئینی با فن Western Blotting:
به‌منظور تأیید محصولات پروتئینی از فن Western Blotting استفاده شد. در شکل 7 در ستون شماره 3 یک باند در محدوده 19 کیلو دالتون مشاهده شد که مربوط به پروتئین آزورین است.
چاهک 1- خروجی ستون پس از بارگذاری پروتئین، چاهک 2- شست‌وشو توسط بافر حاوی اوره 8 مولار، چاهک 3- نشانگر پروتئین، چاهک 4 الی 8-Elutions
تأیید محصولات پروتئینی با فن Western Blotting:
به‌منظور تأیید محصولات پروتئینی از فن Western Blotting استفاده شد. در شکل 7 در ستون شماره 3 یک باند در محدوده 19 کیلو دالتون مشاهده شد که مربوط به پروتئین آزورین است.
شکل (7): نتیجه وسترن بلاتینگ به‌منظور تأیید محصول پروتئین نوترکیب آزورین
ستون 1) کنترل مثبت (لزوماً آزورین نیست و پروتئینی است که قبلاً در آزمایشگاه کار شده و جهت تأیید وسترن بلاتینگ استفاده شد)، ستون M ) نشانگر اندازه پروتئین، ستون 2) کنترل منفی،
3) پروتئین نوترکیب تولیدشده
بررسی سمیت آزورین در رده سلولی MCF7 و رده سلولی HEK293:
نمودار (1) بیانگر افزایش سیتوتوکسیستی و کاهش زنده‌مانی سلول‌های سرطانی با افزایش غلظت پروتئین آزورین است، بنابراین درصد سیتوتوکسیسیتی این پروتئین روی رده سلولی MCF7 با غلظت پروتئین نوترکیب ارتباط مستقیم و درصد زنده‌مانی سلول‌های سرطانی با غلظت پروتئین نوترکیب ارتباط معکوس دارد. همان‌طوری که در نمودار (1) مشاهده می‌شود میزان سمیت آزورین در رده سلولی MCF7 بیشتر است. با توجه به P<0.05 بنابراین میزان سمیت آزورین در رده سلولی MCF7 با رده سلولی HEK293 برابر نیست.
ستون 1) کنترل مثبت (لزوماً آزورین نیست و پروتئینی است که قبلاً در آزمایشگاه کار شده و جهت تأیید وسترن بلاتینگ استفاده شد)، ستون M ) نشانگر اندازه پروتئین، ستون 2) کنترل منفی،
3) پروتئین نوترکیب تولیدشده
بررسی سمیت آزورین در رده سلولی MCF7 و رده سلولی HEK293:
نمودار (1) بیانگر افزایش سیتوتوکسیستی و کاهش زنده‌مانی سلول‌های سرطانی با افزایش غلظت پروتئین آزورین است، بنابراین درصد سیتوتوکسیسیتی این پروتئین روی رده سلولی MCF7 با غلظت پروتئین نوترکیب ارتباط مستقیم و درصد زنده‌مانی سلول‌های سرطانی با غلظت پروتئین نوترکیب ارتباط معکوس دارد. همان‌طوری که در نمودار (1) مشاهده می‌شود میزان سمیت آزورین در رده سلولی MCF7 بیشتر است. با توجه به P<0.05 بنابراین میزان سمیت آزورین در رده سلولی MCF7 با رده سلولی HEK293 برابر نیست.
نمودار (1): سمیت آزورین در رده‌های سلولی MCF7 و HEK293 رشد یافته در پلیت 96 خانه‌ای با غلظت‌های مختلف آزورین به مدت 24 ساعت. همه‌ی نتایج به درصد بیان شده است.
بحث و نتیجه‌گیری
سرطان پستان یکی از شایع‌ترین بیماری‌های بدخیم زنان در سراسر دنیا است که امروزه به یکی از معضلات سازمان‌های بهداشتی تبدیل شده است. سرطان پستان حدود 25 درصد از سرطان‌های زنان را شامل می‌شود. در ایران مانند دیگر کشورهای درحال‌توسعه‌ی آسیا و آفریقا سرطان پستان زنان را حداقل یک دهه جوان‌تر از همتایان خود در کشورهای توسعه‌یافته تحت تأثیر قرار می‌دهد. در درمان سرطان پستان با توجه به شرایط بیمار از روش‌های مختلفی همچون جراحی، شیمی‌درمانی، پرتودرمانی، هورمون درمانی و آنتی‌بادی‌های مونوکلونال استفاده می‌شود. با توجه به عوارض روش‌های درمانی مذکور و میزان تأثیر این روش‌ها بر درمان بیماران و از طرف دیگر هزینه بالای این روش‌ها، نیاز مبرمی به استفاده از فنّاوری‌های نوین برای یافتن روش‌های جدید و پربازده با عوارض جانبی و هزینه کمتر برای درمان احساس می‌شود (18). عدم اثر انتخابی علیه سلول‌های سرطانی یکی از مهم‌ترین ایراد درمان‌های متداول سرطان است. هدف‌گیری انحصاری سلول‌های غیرطبیعی، مرکز تلاش‌های جهانی در زمینه درمان سرطان بوده است (19). در قرن‌های گذشته مشاهداتی در مورد پدیده‌ی برگشت خود به خودی تومورهای مرتبط با عفونت‌های باکتریایی وجود داشته است (20). در اواخر سال 1890 پزشک آمریکایی کولی در مورد یک روند درمانی بر اساس این پدیده گزارش داد (21). ارتباط بین عفونت باکتریایی و برگشت سرطان مشاهده شد. این مشاهدات او را به کشف یک واکسن باکتریایی کشته‌شده برای سرطان، معروف به توکسین کولی رساند (20). سرانجام به توسعه‌ی روش‌های درمانی جدید ضد سرطان بر اساس استفاده از باکتری‌های زنده و محصولات تولیدشده به‌وسیله‌ی آن‌ها ازجمله سموم باکتریایی، پروتئین‌ها، پپتیدها و آنزیم‌ها جهت داد. اخیراً، تعدادی از پروتئین‌ها و پپتیدهای باکتریایی توصیف شده است که فعالیت ضد سرطانی را در سطح پیش بالینی نسبت به انواع مختلف سلول‌های سرطانی نشان می‌دهند (22). اکتریوسین‌ها نشان داده‌اند که می‌توانند یک عامل درمانی فعال باشند و خواص بیوشیمیایی آن‌ها موردمطالعه قرار گرفته است. سودوموناس آئروژینوزا یک باکتری بیماری‌زای گرم منفی دارای توانایی تولید پروتئین آزورین ضد سرطانی است. پروتئین آزورین می‌تواند به‌عنوان سلاحی برای حمله به سرطان‌ها، انگل‌ها و ویروس‌ها مورداستفاده قرار گیرد (23). سمیت سلولی آزورین فقط برای سلول‌های سرطانی است و بر سلول‌های سالم تأثیر نمی‌گذارد و عوارض جانبی سمی کمتری دارد. تعداد فوق‌العاده‌ای از مواد درمانی می‌توانند به مولکول آزورین متصل شوند و آن به دلیل توانایی عمل به‌عنوان پروتئین حامل است (24). داروهای شیمی‌درمانی امروزی که برای درمان سرطان استفاده می‌شوند اغلب سمی هستند و مستعد ایجاد مقاومت توسط سلول‌های سرطانی هستند که درنهایت منجر به تومورهای مقاوم به دارو می‌شوند. توانایی آزورین در تداخل یا برگشت رشد تومور در نقاط مختلف حمله ممکن است در پیشگیری از پیشرفت مقاومت مؤثر باشد. از ویژگی چنین پروتئینی می‌توان به‌عنوان سلاحی برای افزایش طیف وسیعی از روش‌ها مانند فعالیت ضد سرطانی و ضد انگلی استفاده کرد. آزورین می‌تواند از القای تشکیل ضایعات پیش سرطانی جلوگیری کند. یک ماده سرطان‌زا می‌تواند باعث ایجاد ضایعه‌ی پیش سرطانی شود (25). آزورین وارد سلول‌های سرطانی پستان می‌شود و باعث مرگ سلولی آپوپتوتیک می‌شود. مرگ سلول‌های سرطانی با تشکیل کمپلکس با پروتئین شناخته‌شده‌ی p53 سرکوب‌کننده‌ی تومور صورت می‌گیرد. فرم پایدار پروتئین p53 همراه با فعال‌سازی کاسپازها باعث آپوپتوز در سلول‌های سرطانی می‌شود (26). یافته‌های ما حکایت از سمیت آزورین در هر دو رده‌ی سلولی MCF7 و HEK293 دارد ولی سمیت آزورین روی رده سلولی MCF7 بیشتر است، به‌طوری‌که آزورین در کمترین غلظت دارای 4درصد اثر سیتوتوکسیک روی رده سلولی MCF7 است و این حاکی از اثر انتخابی آزورین روی سلول‌های سرطانی است. گزارشات مختلفی از توان ضد سرطانی آزورین در مطالعات قبلی ارائه شده است. نفیسه پایدارنیا و همکاران اثر سمیت سینرژیسمی پروتئین هم جوش گرانزیم –B آزورین روی سلول‌های سرطانی پستان را اثبات کردند و اثر سیتوتوکسیک قابل‌توجه در سلول‌های MCF7 و MDA-MB-231 و SK-BR-3 مشاهده کردند درحالی‌که اثر سیتوتوکسیک قابل‌توجهی در سلول‌های طبیعی MCF10A مشاهده نکردند. Paydarnia و همکاران (2019) و Mohamed MS و همکاران (2010) اثر آزورین را به‌عنوان پروتئین ضد تومور در رده‌های سلولی سرطان نشان دادند و آزورین به‌شدت از تکثیر رده سلولی سرطان روده بزرگ HCT116 و رده سلولی سرطان پستان MCF7 جلوگیری کرد و آزورین هیچ تأثیری بر ملانوسیت‌های طبیعی HFB4 نشان نداد. Kim UK و همکاران اثر آزورین نوترکیب را در سلول‌های سرطان سنگفرش دهان اثبات نمودند و آزورین اثر سیتوتوکسیک وابسته به دوز در سلول‌های YD-9 نشان داد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که آزورین می‌تواند تا حدودی علیه سلول سرطانی گزینشی عمل کند و اثر ضدسرطانی بالقوه‌ای روی رده سلولی MCF7 داشته باشد.
تشکر و قدردانی:
از تمامی کسانی که ما را در این مطالعه یاری فرمودند تشکر و قدردانی می‌کنیم.
حمایت مالی:
ندارد.
تضاد منافع:
نویسندگان در این مطالعه هیچ تضاد منافعی نداشتند.
ملاحظات اخلاقی:
این مطالعه با در نظر گرفتن ملاحظات اخلاقی برای انجام امور پژوهشی اقدام شده است.
نوع مطالعه: پژوهشي(توصیفی- تحلیلی) |
موضوع مقاله:
میکروبیولوژی
فهرست منابع
1. Van De KM, Mc S, Brunori M, Van BJ, Fc H, Gw C. Involvement of the hydrophobic patch of azurin in the electron-transfer reactions with cytochrome c551 and nitrite reductase. Eur J Biochem 1990;194(1):109-18. [DOI:10.1111/j.1432-1033.1990.tb19434.x] [PMID]
2. Karpiński TM, Szkaradkiewicz AK. Anti-cancer peptides from bacteria. Bangl J Pharmacol 2013;8(3):343-8. [DOI:10.3329/bjp.v8i3.15704]
3. Fialho A, Das Gupta T, Chakrabarty A. Designing promiscuous drugs? Look at what nature made! Lett Drug Des Discov 2007;4(1):40-3. [DOI:10.2174/157018007778992946]
4. Bernardes N, Seruca R, Chakrabarty AM, Fialho AM. Microbial-based therapy of cancer: current progress and future prospects. Bioeng Bugs 2010;1(3):178-90. [DOI:10.4161/bbug.1.3.10903] [PMID] []
5. Yamada T, Hiraoka Y, Ikehata M, Kimbara K, Avner BS, Das Gupta TK, et al. Apoptosis or growth arrest: Modulation of tumor suppressor p53's specificity by bacterial redox protein azurin. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101(14):4770-5. [DOI:10.1073/pnas.0400899101] [PMID] []
6. Nguyen C, Nguyen VD. Discovery of azurin-like anticancer bacteriocins from human gut microbiome through homology modeling and molecular docking against the tumor suppressor p53. Biomed Res Int 2016;2016:8490482. [DOI:10.1155/2016/8490482] [PMID] []
7. Gao M, Zhou J, Su Z, Huang Y. Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein-protein interactions and cancer therapy: Azurin Hijacks Cellular Signaling Networks. Protein Sci 2017;26(12):2334-41.. [DOI:10.1002/pro.3310] [PMID] []
8. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C. Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012. Int Agency for Res on Cancer 2012. [URL]
9. Nooshinfar E, Bashash D. Melatonin and its importance in breast cancer prevention and treatment (A purposed review article). Iran J Obstet Gynecol Infertil 2014;17:10-21. [Google Scholar]
10. Dao KL, Hanson RN. Targeting the estrogen receptor using steroid-therapeutic drug conjugates (hybrids). Bioconjug Chem 2012b;23(11):2139-58. [DOI:10.1021/bc300378e] [PMID]
11. Feng Y, Spezia M, Huang S, Yuan C, Zeng Z, Zhang L, et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis 2018;5(2):77-106. [DOI:10.1016/j.gendis.2018.05.001] [PMID] []
12. Mehta RR, Yamada T, Taylor BN, Christov K, King ML, Majumdar D, et al. A cell penetrating peptide derived from azurin inhibits angiogenesis and tumor growth by inhibiting phosphorylation of VEGFR-2, FAK and Akt. Angiogenesis 2011;14(3):355-69. [DOI:10.1007/s10456-011-9220-6] [PMID]
13. Bernardes N, Ribeiro AS, Abreu S, Mota B, Matos RG, Arraiano CM, et al. The bacterial protein azurin impairs invasion and FAK/Src signaling in P-cadherin-overexpressing breast cancer cell models. PLoS One 2013;8(7):e69023. [DOI:10.1371/journal.pone.0069023] [PMID] []
14. Yamada T, Goto M, Punj V, Zaborina O, Chen ML, Kimbara K, et al. Bacterial redox protein azurin, tumor suppressor protein p53, and regression of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(22):14098-103.. [DOI:10.1073/pnas.222539699] [PMID] []
15. Fialho AM, Bernardes N, Chakrabarty AM. Exploring the anticancer potential of the bacterial protein azurin. Aims Microbiol 2016;2(3):292-303. [DOI:10.3934/microbiol.2016.3.292]
16. Taherimehr Z, Zaboli M, Torkzadeh-Mahani M. New insight into the molecular mechanism of the trehalose effect on urate oxidase stability. J Biomol Struct Dyn 2022;40(4):1461-71. [DOI:10.1080/07391102.2020.1828167] [PMID]
17. Shandiz SAS, Sharifian F, Behboodi S, Ghodratpour F, Baghbani-Arani F. Evaluation of metastasis suppressor genes expression and in vitro anti-cancer effects of Zinc Oxide Nanoparticles in human breast cancer cell lines MCF-7 and T47D. Avicenna J Med Biotechnol 2021;13(1):9-14. [PMID]
18. Ghodratpour F, Fahimeh, Shandiz S. Cytotoxic effects of Zn oxide nanoparticles against breast cancer T47D cells and NM23 gene expression. Feyz 2018;6:589-94. [Google Scholar]
19. Bar-Zeev M, Livney YD, Assaraf YG. Targeted nanomedicine for cancer therapeutics: Towards precision medicine overcoming drug resistance. Drug Resist Updat 2017;31:15-30.. [DOI:10.1016/j.drup.2017.05.002] [PMID]
20. Felgner S, Kocijancic D, Frahm M, Weiss S. Bacteria in cancer therapy: Renaissance of an old concept. Int J Microbiol 2016;2016:8451728. [DOI:10.1155/2016/8451728] [PMID] []
21. Coley WB. Contribution to the knowledge of sarcoma. Ann Surg 1891;14:199-220. [DOI:10.1097/00000658-189112000-00015] [PMID] []
22. Chakrabarty AM, Bernardes N, Fialho AM. Bacterial proteins and peptides in cancer therapy: today and tomorrow: Today and tomorrow. Bioengineered 2014;5(4):234-42. [DOI:10.4161/bioe.29266] [PMID] []
23. Yamada T, Fialho AM, Punj V, Bratescu L, Gupta TK, Chakrabarty AM. Internalization of bacterial redox protein azurin in mammalian cells: entry domain and specificity. Cell Microbiol 2005;7(10):1418-31. [DOI:10.1111/j.1462-5822.2005.00567.x] [PMID]
24. Mahfouz M, Hashimoto W, Gupta TK, Chakrabarty AM. Bacterial proteins and CpG-rich extrachromosomal DNA in potential cancer therapy. Plasmid 2007;57(1):4-17. [DOI:10.1016/j.plasmid.2006.11.001] [PMID]
25. Tangri S, Ishioka GY, Huang X, Sidney J, Southwood S, Fikes J, et al. Structural features of peptide analogs of human histocompatibility leukocyte antigen class I epitopes that are more potent and immunogenic than wild-type peptide. J Exp Med2001;194(6):833-46. [DOI:10.1084/jem.194.6.833] [PMID] []
26. Vijgenboom E, Busch JE, Canters GW. In vivo studies disprove an obligatory role of azurin in denitrification in Pseudomonas aeruginosa and show that azu expression is under control of rpoS and ANR. Microbiology 1997;143 (Pt 9)(9):2853-63. [DOI:10.1099/00221287-143-9-2853] [PMID]
27. Paydarnia N, Khoshtinat Nikkhoi S, Fakhravar A, Mehdiabdol M, Heydarzadeh H, Ranjbar S. Synergistic effect of granzyme B-azurin fusion protein on breast cancer cells. Mol Biol Rep 2019;46(3):3129-40. [DOI:10.1007/s11033-019-04767-x] [PMID]
28. Mohamed MS, Said A, Howayada M. Azurin as antitumor protein and its effect on the cancer cell lines. Curr Res J Biol Sci 2010; (2):396-401. [URL]
29. Kim UK. Recombinant Azurin from Pseudomonas aeruginosa Induces Apoptotic Cell Death in Oral Squamous Carcinoma Cells. Int J Oral biology 2010;2:35-42. [Google Scholar]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
