fa بیان مینی ژنهای فاکتور 9 انعقادی انسانی در سلولهای کلیه انسان ژنتیک ژنتیک پژوهشي(توصیفی- تحلیلی) Research <p dir="RTL"><strong>پیش‌زمینه و هدف: </strong>نقص در عملکرد فاکتور 9 منجر به بیماری هموفیلی <span dir="LTR">B</span> می‌گردد. استفاده از فرآورده‌های پلاسمایی جهت جلوگیری از خونریزی، خطر انتقال عوامل عفونی را افزایش می‌دهد. بنابراین امروزه استفاده از فاکتور 9 نوترکیب، به‌عنوان جایگزین مناسب نوع پلاسمایی آن مطرح شده است. به‌منظور بیان و تولید فاکتور 9 نوترکیب، استفاده از یک وکتور بیانی با توالی‌های تنظیمی سیس مناسب ازجمله توالی‌های اینترونی لازم است.</p> <p dir="RTL"><strong>مواد و روش‌ کار</strong>: 4 وکتور پلاسمیدی بیان‌کننده فاکتور 9 که فاقد و واجد اینترون‌های ژن بتا گلوبین (در جایگاه معادل خود در <span dir="LTR">cDNA</span> فاکتور 9 ) ساخته شدند و با روش لیپوفکشن به سلول‌های <span dir="LTR">Hek-293T</span> ترانسفکت شدند. سپس کارایی پلاسمیدها در بیان فاکتور 9 با انجام آزمون الایزا بر محیط کشت سلول‌ها در 3 روز متوالی پس از ترانسفکشن و نیز آزمون نیمه کمی <span dir="LTR">RT-PCR </span>&nbsp;انجام پذیرفت.</p> <p dir="RTL"><strong>یافته‌ها</strong>: در روز سوم پس از ترانسفکشن، بالاترین بیان فاکتور 9 از سازه ژنی بدون اینترون و سازه ژنی دارای اینترون 1 بتا گلوبین به‌دست آمد. در بیان فاکتور 9، اینترون 1 بتا گلوبین مؤثرتر از اینترون 2 آن بود. همچنین بر مبنای نتایج <span dir="LTR">RT-PCR</span> نیمه کمی، بالاترین میزان <span dir="LTR">mRNA</span> از سازه ژنی بدون اینترون به‌دست آمد.&nbsp;</p> <p dir="RTL"><strong>بحث و نتیجه‌گیری</strong>: سازه‌های ژنی بدون اینترون و دارای اینترون 1 ژن بتا گلوبین، کاراترین سازه‌ها در بیان فاکتور 9 بودند. استفاده از اینترون‌های بتا گلوبین در <span dir="LTR">cDNA</span> فاکتور 9&nbsp; بیان این پروتئین را در مقایسه با سازه ژنی بدون اینترون کاهش داد. این کاهش بیان را می‌توان با احتمال، به اسپلایسینگ نادرست اینترون‌های بتا گلوبین در <span dir="LTR">cDNA</span>&nbsp; فاکتور 9 نسبت داد.</p> <p dir="LTR"><strong><em>Background</em></strong><em> <strong>& aims</strong></em>: Hemophilia B is caused by either functional deficiency or lack of the human coagulation factor IX (hFIX). The current protein-based therapy with plasma-derived proteins increases, the risk of blood-borne pathogens transmission. Therefore, replacement therapy with recombinant hFIX (rhFIX) is an attractive alternative to plasma derived hFIX concentrates. In order to express and produce rhFIX protein, an efficient expression vector with suitable <em>cis-</em>regulatory elements such as intronic sequences is required.</p> <p dir="LTR"><strong><em>Materials & Methods</em></strong>: Four <em>hFIX</em>-expressing plasmids with or without human &beta;-globin <em>(hBG)</em> introns (intron I and intron II) inside the <em>hFIX-cDNA</em> and the Kozak element were constructed and introduced into the Hek-293T cells using transfection method. Next, the efficacies of the plasmids were evaluated by performing ELISA on cultured media during 3 days of post-transfection as well as semi-quantitative RT-PCR.</p> <p dir="LTR"><strong><em>Results</em></strong><strong>:</strong> The highest hFIX expression levels were obtained from the intron-less and intron-I containing plasmids after 3 days of transfection. The first <em>hBG </em>intron was more effective than the second one. Furthermore, the highest mRNA level was obtained from the intron-less construct.</p> <p dir="LTR"><strong><em>Conclusion</em></strong><strong>:</strong> Intron-less and intron-I containing plasmids were more effective compared to other constructs for expression of hFIX. Application of the <em>hBG </em>intronic sequences reduced the hFIX expression levels, probably due to improper splicing of the <em>hBG </em>introns from the hFIX pre-mRNAs.</p> <p align="center" dir="LTR"></p> <p align="center" dir="LTR">SOURCE: URMIA MED J 2016: 27(7): 597 ISSN: 1027-3727</p> هموفیلی B, فاکتور 9 انعقادی , اینترون های ژن بتا گلوبین, وکتور پلاسمیدی, Hek-293T Hemophilia B, Human coagulation factor IX, human β-globin (hBG) introns, Plasmid vectors, Hek-293T 589 597 http://umj.umsu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-2474-1&slc_lang=fa&sid=1 Mohammad Reza Sam محمد رضا سام s_mohammadreza@yahoo.com 3700319475328460016017 3700319475328460016017 Yes Urmia University دانشگاه ارومیه Alireza Zomorodipour علیرضا زمردی پور zomorodi1@yahoo.com 3700319475328460016018 3700319475328460016018 No National Institute of Genetic and Biotechnology پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک Aliakbar Haddad-Mashadrizeh علی اکبر حداد مشهدریزه aliakbar.haddad@gmail.com 3700319475328460016019 3700319475328460016019 No Ferdowsi University of Mashhad دانشگاه مشهد Mahdi Ghorbani مهدی قربانی m.ghorbani@gmail.com 3700319475328460016020 3700319475328460016020 No National Institute of Genetic Engineering پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک Gholam Ali Kardar غلامعلی کاردر kardar51@yahoo.com 3700319475328460016021 3700319475328460016021 No Tehran university of medical Sciences دانشگاه علوم پزشکی تهران