Studies in Medical Sciences

fa تولید انبوه آنتی‌بادی مونوکلونال علیه پپتید خارج سلولی CD20 و ارزیابی اتصال اختصاصی آن به سلول‌های بیان‌کننده CD20 LARGE SCALE GENERATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST EXTERACELLULAR PEPTIDE OF CD20 AND EVALUATION OF SPECIFIC BINDING TO CD20 EXPRESSING CELLS آناتومی آناتومی پژوهشي(توصیفی- تحلیلی) Research پیش‌زمینه و هدف: امروزه با پیشرفت فنّاوری هیبریدوما در تولید آنتی‌بادی‌های مونوکلونال این امکان فراهم شده که به‌واسطه این مواد، مارکرهای مختلف سلولی در سطح سلول‌های نرمال و بدخیم ارزیابی گردد. CD20، فسفوپروتئین غیر گلیکوزیله، یک مارکر مناسب در تشخیص لوسمی و لنفوم‌ها می‌باشد که تقریباً در 95 درصد از سلول‌های B نرمال و بدخیم به جز در سلول‌های اولیه و پلاسماسل، بیان می‌گردد. هدف این مطالعه تولید آنتی‌بادی مونوکلونال برعلیه مارکر CD20 و ارزیابی اتصال اختصاصی آن در سلول‌های بیان کننده CD20 می‌باشد.مواد و روش‌ها: ابتدا موش‌های Balb/c در چهار نوبت با 100 میکروگرم پپتید خارج سلولی CD20، ایمونیزه گردیدند و سپس فیوژن سلول‌های طحال ایمن‌ترین موش با سلول‌های میلومایی SP2/0 به‌وسیله پلی‌اتیلن گلیکول( (PEG صورت گرفت. کلون مطلوب برای رقت سازی محدود ((limiting dilution انتخاب گردید. تولید انبوه آنتی‌بادی مونوکلونال به روش مایع آسیت صورت گرفت. تخلیص آنتی‌بادی مونوکلونال با روش افینیتی کروماتوگرافی پروتئین A انجام شد و با SDS-PAGE نیز تأیید گردید. اتصال اختصاصی آنتی‌بادی با ارزیابی‌های ایمونولوژیکی مثل الایزا و ایمونوفلورسانس و فلوسایتومتری صورت گرفت.یافته‌ها: پس از انجام فیوژن سلولی و غربالگری کلون‌ها، یک کلون مطلوب با جذب نوری((OD حدود 2 در آزمون الایزا به دست آمد. با تخلیص مایع آسیت با ستون افینیتی کروماتوگرافی پروتئین A , 5 میلی‌گرم آنتی‌بادی مونوکلونال خالص به دست آمد. نتایج SDS-PAGE خلوص محصول کروماتوگرافی را تأیید نمود. نتایج الایزا و ایمونوفلورسانس و فلوسایتومتری اتصال اختصاصی به CD20 را نیز تأیید نمود.نتیجه‌گیری: نتایج نشان می‌دهد که از آنتی‌بادی مونوکلونال تولیدشده علیه CD20 می‌توان در ارزیابی‌های ایمونولوژیکی نظیر الایزا و ایمونوفلورسانس و فلوسایتومتری استفاده نمود. Background & Aims: Nowadays, by advent of hybridoma technology in monoclonal antibodies production various cell markers could be evaluated in malignant and non-malignant cells. CD20, non-glycosylated phosphoprotein is as an ideal marker in leukemia and B-cell lymphoma diagnosis which is expressed on more than 95% of normal and neoplastic B-cells except for early B-cells and mature plasma. The prime aim of this study was to produce monoclonal antibody against CD20 and evaluation of specific binding to CD20 expressing cells. Materials & Methods: First, Balb/c mice were immunized 4 times with 100µg peptide from extracellular domain of CD20. Spleen cells of the most immune mouse were fused with SP2/0 by Poly Ethylene Glycol (PEG). The desired clones were selected for limiting dilution (L.D). Large scale of monoclonal antibodies was produced by ascetic fluid method. Monoclonal antibody was purified by Protein-A-Sepharose column affinity chromatography then confirmed by SDS-PAGE. Afterward, evaluation of specific binding of these antibodies was determined by immunological assay such as ELISA and Immunofluorescence and flowcytometry. Results: After cell fusion and screening, one desired monoclone achieved with absorbance about 2. Protein-A-Sepharose column affinity chromatography yielded about 5 mg of purified monoclonal antibody. The SDS-PAGE results confirmed purification of antibody. The result of ELISA, direct immunofluorescence staining and flow cytometry confirmed specific attachment to CD20. Conclusions: These results indicate that such monoclonal antibodies against CD20 can be used in diagnosis of CD20 in the cells surface by immunological assay such as ELISA and Immunofluorescence and flowcytometry. SOURCE: URMIA MED J 2014: 25(4): 372 ISSN: 1027-3727 <a name="_GoBack"></a> آنتی‌بادی مونوکلونال, CD20, افینیتی کروماتوگرافی, فلوسایتومتری Monoclonal antibodies, CD20, Affinity chromatography, Flowcytometry 363 372 http://umj.umsu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-582-481&slc_lang=fa&sid=1 Koushan Sineh Sepehr کوشان سینه سپهر 370031947532846009697 370031947532846009697 No Department of Immunology, Faculty of Medicine, Tabriz University of Medical Sciences دانشگاه علوم پزشکی تبریز، دانشکده پزشکی، گروه ایمنی شناسی پزشکی، Behzad Baradaran بهزاد برادران behzad_im@ymail.com 370031947532846009698 370031947532846009698 Yes Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences مرکز تحقیقات کاربردی دارویی، داشگاه علوم پزشکی تبریز، Jafar Majidi جعفر مجیدی 370031947532846009699 370031947532846009699 No Medical Immunology Department, Immunology Research Center (IRC), Tabriz University of Medical Science مرکز تحقیقات ایمونولوژی، داشگاه علوم پزشکی تبریز، Jalal Abdolalizadeh جلال عبدالعلی زاده 370031947532846009700 370031947532846009700 No Clinical Biochemistry Department, Immunology Research Center (IRC), Tabriz University of Medical Science مرکز تحقیقات ایمونولوژی، داشگاه علوم پزشکی تبریز،