fa مهندسی آنزیم درمانی اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس با استفاده از روش جهش‌زایی هدف‌دار بیوشیمی بیوشیمی پژوهشي(توصیفی- تحلیلی) Research <strong><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">پیش‌زمینه و هدف:</span></span></strong><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس (</span></span><span dir="LTR">EC 1.7.3.3</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">) به‌عنوان یک آنزیم دارویی دارای کاربردهای درمانی ازجمله کاهش اورات سمی بوده و در درمان بالینی اختلالات نقرس، نفروپاتی و هایپراوریسمی ناشی از سندروم لیز توموری </span></span><span dir="LTR">(TLS)</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> استفاده می‌شود. علی‌رغم داشتن تمایل و ویژگی بالا در تبدیل سوبسترا به محصول، پایداری کم آن در برابر حرارت، کاربرد آن را با محدودیت مواجه ساخته است. برای حل این چالش راهکارهای متعددی وجود دارد که ازجمله آن‌ها می‌توان به مهندسی پروتئین و دستکاری ژنتیکی اشاره کرد. هدف از این تحقیق طراحی و ایجاد پل‌های دی‌سولفیدی برای اولین بار در آنزیم اوریکاز می‌باشد.</span></span><br> <strong><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">مواد و روش‌ کار</span></span></strong><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">: در این تحقیق با استفاده از مطالعات بیوانفوماتیکی و سرور‌های موجود</span></span> <span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">و با در نظر گرفتن کد </span></span><span dir="LTR">pdb</span> <span dir="LTR">1xxj</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">، موقعیت‌های صحیح برای ایجاد پیوند دی‌سولفیدی در آنزیم اوریکاز انتخاب شد. سپس با روش جهش‌زایی هدف‌دار و روش </span></span><span dir="LTR">SOE-PCR</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> جهش‌های انتخابی ایجاد شدند.</span></span><br> <strong><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">یافته‌ها</span></span></strong>: <span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">شش جایگاه احتمالی تشکیل پیوند دی‌سولفیدی گزینش شد که شامل سه پیوند دی‌سولفیدی داخل زنجیره‌ای و سه پیوند دی‌سولفیدی بین زنجیره‌ای شامل </span></span><span dir="LTR">Ser 145-Thr 185</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">، </span></span><span dir="LTR">Ala 235-Val 248</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">، </span></span><span dir="LTR">His 256-Gln 281</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">، </span></span><span dir="LTR">Ala 6-Cys290</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">، </span></span><span dir="LTR">Ser282-Ser282</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">، </span></span><span dir="LTR">Asn12-Asp283</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> می‌باشند که با جهش دادن آن‌ها به سیستئین پیوند دی‌سولفیدی تشکیل می‌شود. در این پروژه نتایج حاصل از </span></span><span dir="LTR">SOE-PCR</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> و کلونینگ برای جهش نقطه‌ای </span></span><span dir="LTR">Ala6</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> و </span></span><span dir="LTR">Ser282</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> با موفقیت توسط روش‌های کلونی </span></span><span dir="LTR">PCR</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> و هضم آنزیمی و درنهایت تعیین توالی، تأیید شدند.</span></span><br> <strong><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">بحث و نتیجه‌گیری</span></span></strong><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;">: در این تحقیق با موفقیت مکان‌هایی برای جهش به اسیدآمینه سیستئین تعیین شد و توسط روش </span></span><span dir="LTR">SOE-PCR</span><span style="font-family:nazanin;"><span style="font-size:9.5pt;"> با موفقیت جهش‌زایی انجام شد.</span></span> <a name="_Toc416081061"><strong><em>Background & Aims:</em></strong></a> As a therapeutic enzyme, Aspergillus flavus (uricase or; EC 1.7.3.3), is used for treatment of urate deposits, gout and nephropathy, hyperuricemia and tumor lysis syndrom (TLS). Despite desirable kinetic features, fragile stability of uricase limits its wide range applications. Therefore, several approaches have developed such as protein engineering and genetic manipulations to overcome these problems. The main aim of the current research was the design and creation of disulfide bridge in therapeutic enzyme uricase for the first time.<br> <strong><em>Materials & Methods:</em></strong> By the help of bioinformatics studies and based on protein data bank (PDB) code: 1xxj, the potential points for disulfide bridge formation were selected. To create mutations, site-directed mutagenesis using SOE-PCR was employed.<br> <strong><em>Results</em></strong>: According to computational tools, six potential pairs including three intra and three inter-chains were predicted to form disulfide when mutated to cysteins as followings: Ser145-Thr185, Ala235-Val248, His256-Gln281 and Ala6-Cys290, Ser282&ndash;Ser282, Asn12-Asp283. By means of SOE-PCR, mutation and cloning of Ala6 and Ser282 was implemented and verified by colony PCR, digestion check and eventually by sequencing.<br> <strong><em>Conclusion</em></strong><strong><em>:</em></strong> In the current research, we successfully determined the location for mutating to cystein and fortunately implemented mutagenesis by SOE-PCR. اوریکاز, پیوند دی‌سولفیدی, جهش زایی هدف‌دار , SOE-PCR, نقرس Uricase, disulfide bond, site-directed mutagenesis, SOE-PCR, gout 50 62 http://umj.umsu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3610-1&slc_lang=fa&sid=1 Leila Rezaeian Marjani لیلا رضائیان st_l.rezaeian@urmia.ac.ir 3700319475328460020639 3700319475328460020639 No Department of Cellular and Molecular Biotechnology, Institute of Biotechnology, Urmia University, Urmia, Iran دانشگاه ارومیه Mehdi Imani مهدی ایمانی m.imani@urmia.ac.ir 3700319475328460020640 3700319475328460020640 Yes Department of Basic Sciences, School of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran دانشگاه ارومیه Hossein Zarei Jalian حسین زارعی جلیانی zarei.j@gmail.com 3700319475328460020641 3700319475328460020641 No Department of Genetics, School of Medicine, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یز